Kit de 4 PYROSTAR™ ES-F (2,0 mL) com o Controle Padrão de Endotoxina (CPE)

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PYROSTAR™ ES-F

Ampola multiteste com (2,0 mL e 5,2 mL) com o Controle Padrão de Endotoxina (CPE) 

Uso: Lisado de Amebócitos de Límulo (LAL) destina-se à detecção de endotoxinas bacterianas gram-negativas. PYROSTAR™ ES-F é para a detecção qualitativa das endotoxinas por formação de gel (gel-clote) ou a detecção quantitativa das endotoxinas pelos métodos cinéticos turbidimétricos. A escala quantitativa para o Ensaio Cinético Turbidimétrico (ECT) é baseada na sensibilidade ao lisado com formação de gel. Consulte a tabela abaixo:

Resumo e informações gerais

Endotoxina (lipopolissacarídeo ou LPS) é um componente da membrana exterior de bactérias gram-negativas. Uma vez que as endotoxinas, quando injetadas ou implantadas, podem causar febre e/ou o choque, a detecção de endotoxinas bacterianas nos produtos farmacêuticos e nos dispositivos médicos é crucial.

O teste de LAL é o método mais sensível para a detecção dos endotoxinas bacterianas atualmente aprovado pelo FDA.² A primeira metodologia usada para determinar os resultados de teste de LAL era a formação de um gel-clote no fundo de um tubo de reação de vidro. Também foi observado que a solução do teste se torna turva antes da formação do gel. O tempo necessário para produzir um nível específico de turvação é inversamente proporcional à quantidade de endotoxina em uma amostra.¹

Um instrumento fotométrico, tal como o Toxinometer (Wako Indústrias Químicas Ltda.) é usado para medir a taxa da mudança da turvação. Este procedimento quantitativo é frequentemente chamado de Ensaio Cinético Turbidimétrico (ECT).

Utilizando estas propriedades, a Wako Produtos Químicos desenvolveu um teste de endotoxina de LAL que pode ser usado tanto como teste turbidimétrico quantitativo quanto como teste de gel qualitativo.

O teste de endotoxinas bacterianas da USP <85>⁶ fornece procedimentos padronizados para a validação antes do uso rotineiro.

No entanto, a especificidade de LAL não é absoluta. 7 Relatou-se que LAL reage não somente com a endotoxina, mas também com o β-1, 3-glucano. Embora o sistema em cascata ativado por β-1,3-glucano mostrou ser diferente do que o sistema ativado pela endotoxina, ⁸o resultado final, formação de gel (gel-clote), é indistinguível.

A ativação de LAL pelo glucano em uma amostra pode ser evitada ao adicionar uma quantidade grande de carboximetil-curdlan (gel do polissacarídeo) (CMC) ao LAL. A presença de grandes quantidades de glucano não interfere na quantitação de endotoxina. A Wako empregou primeiramente estes resultados desenvolvendo um tampão-ES, que contém altas concentrações de CMC. Quando o tampão-ES é usado para reconstituir LAL, o reagente de LAL torna-se específico para endotoxina. PYROSTAR™ ES-F é uma preparação nova de LAL em que o CM-curdlan é co-liofilizado com LAL. Reconstituindo as ampolas de multiteste PYROSTAR™ ES-F com água reagente de LAL resulta em um reagente de LAL específico para endotoxina.

História e princípio biológico

A detecção in vitro da endotoxina bacteriana foi feita primeiramente por Levin e Bang.³ A descoberta feita por eles mostrou que o sangue do caranguejo ferradura Limulus polyphemus, coagula na presença de bactérias gram-negativas. Em seguida, esses pioneiros relataram que todos os componentes necessários para a formação do clote poderiam ser isolados dos amebócitos adjacentes encontrados no sangue do Limulus .^3.4

Foi lançado um guia pelo FDA (a agência de administração de alimentos e medicamentos dos Estados Unidos) em 1987⁵ para informar aos fabricantes de medicamentos para humanos, medicamentos veterinários e dispositivos médicos sobre os procedimentos que o FDA considera necessários validar o uso de LAL como produto final do teste de endotoxina. O guia do FDA foi combinado com o o Teste de Endotoxinas Bacterianas da USP em 2000, fazendo com que o método da USP fosse considerado padrão para os fabricantes nos Estados Unidos. O Guia do FDA de 1987 foi retirado em 2011.

Avisos e precauções gerais

PYROSTAR™ ES-F destina-se à detecção in vitro de endotoxinas bacterianas gram-negativas. Tome cuidado ao manusear LAL porque sua toxidez é desconhecida.

Este teste não é um dispositivo diagnóstico e não deve ser usado determinar níveis de endotoxina nos seres humanos para finalidades diagnósticas.

Reagents fornecidos

Reagente PYROSTAR™ ES-F: O PYROSTAR™ ES-F é um reagente liofilizado que contém lisado de amebócitos de límulo, tampões, carboximetil-curdlan, cátions monovalentes e divalentes.

Preparação: Bata levemente na ampola em uma superfície plana para assegurar-se de que todo o pó esteja depositado no fundo da mesma. Remova delicadamente o tampão e adicione 2 mL ou 5,2 mL de água para reagente de LAL (AR) à ampola. Substitua o tampão e gire delicadamente para dissolver o conteúdo, sem fazer contato com o tampão.

Armazenamento: Acondicione à temperatura de 2 a 10^oC. Refrigere o reagente reconstituído entre 2-8°C, por 6 horas no máximo ou em -15±5^oC por 14 dias no máximo. O reagente reconstituído só pode ser congelado e descongelado uma vez.

Controle Padrão de Endotoxina (CPE): Um reagente liofilizado que contém endotoxina refinada de E.coli e que é usado para confirmar a sensibilidade do reagente de LAL, validar métodos de teste de produtos e preparar controles de inibição. CPE pode ser adquirido da Wako Produtos Químicos Ltda.

Preparação: CPE deve reconstituído como especificado pelo fabricante. Após a reconstituição, a ampola deve ser rapidamente agitada ou misturada no agitador de vórtice como instruído pelo fabricante.

Armazenamento: CPE reconstituído deve ser armazenado como instruído pelo fabricante.

CPE não deve ser armazenado nas temperaturas abaixo de zero e deve ser agitado rapidamente ou misturado no agitador de vórtice antes do uso.

Materiais e equipamentos não fornecidos

Padrão de Referência de Endotoxinas (PRE): Padrão de Referência de Endotoxinas da USP que tem uma potência definida de 10.000 Unidades de Endotoxina da USP (EU).

Água para Reagente LAL (AR): Água livre de endotoxina.

Pipetas livres de endotoxinas

Tubos de diluição livres de endotoxinas

Método de Toxinometer

Toxinometer (detector de endotoxinas, Wako Indústrias Químicas Ltda.)

Tubos de ensaio livres de endotoxinas e tampas de alumínio para Toxinometer

Técnicas de Gel-clote (formação de gel)

Incubadora para banho-maria ou aquecimento capaz de manter 37 ± 1oC

Tubos de ensaio e tampas de alumínio livres de endotoxinas

Reparação de diluições para controle padrão de endotoxina

Preparação para controle padrão de endotoxina

Baseado na informação fornecida na Certificação de Análise, prepare um padrão de CPE a uma concentração de 1000 EU/mL, como descrito acima. Misture a solução de 1000EU/mL CPE no agitador de vórtice por 2 minutos na temperatura ambiente. Usando a solução de 1000EU/mL CPE, prepare diluições em série de endotoxina, como mostra a Tabela 1 ou 2.

Misture cada tubo no agitador de vórtice por 30 segundos entre as diluições. As diluições podem ser preparadas em volumes diferentes, contanto que a mesma relação seja mantida.

                                        Tabela 1                                                                                      Tabela 2

                    Esquema da Diluição de Endotoxina                                         Esquema da Diluição de Endotoxina

                         (diluição em séries de 2)                                                             (diluição em séries de 10)

Coleta e preparação do espécime

Reações de LAL são sensíveis ao pH, o que exige que o LAL e a mistura da amostra tenham um pH de 6,0 a 8,0. O PYROSTAR™ ES-F contém os componentes tampão que ajudam a manter a mistura do teste dentro da escala do pH, na maioria dos casos. Se um ajuste do pH for necessário, o pH da amostra deve ser ajustado com HCI ou NaOH livres de endotoxinas.

Interferência do produto

Antes de usar o teste de LAL para a liberação rotineira do produto, é necessário validar a ausência da interferência do produto executando um teste de inibição/realce para cada tipo de produto. Um produto é considerado como não interferente através do teste de uma amostra do produto contaminado com uma quantidade determinada de endotoxina e tal teste detectar 50 - 200% da endotoxina contaminada.

Ensaio Cinético Turbidimétrico (ECT) Prepare uma curva padrão que cubra o alcance do teste. Contamine o produto a um nível de endotoxina que seja igual ou próximo do meio da curva padrão. O produto será considerado não interferente se o nível do endotoxina relatado for 50 a 200% da concentração de endotoxina contaminada. Por exemplo, se uma curva padrão estiver entre 0,1 e 10 EU/mL, o produto deve ser contaminado com endotoxina para resultar uma concentração de 1 EU/mL. O nível aceitável de endotoxina está entre 0,5 e 2,0 EU/mL.

Técnicas de gel-clote (formação de gel) Duas séries independentes de diluição de CSE são preparadas usando o produto e a água para reagente de LAL (AR) como diluentes, respectivamente. Teste a série de diluição de CPE preparada em AR em duplicado (n=2), e a série da diluição de CPE preparada no produto em quadruplicado (n=4). Os pontos geométricos finais médios de ambas as séries de diluição devem cair dentro do limite de duas vezes o nível de sensibilidade à endotoxina informado na etiqueta.

Procedimento para ensaio cinético turbidimétrico

Um ensaio cinético turbidimétrico (ECT) pode ser executado no Toxinometer e no software que o acompanha (Wako Indústrias Químicas, Ltda.).

Além ao produto que está sendo testado, um ensaio válido incluirá os padrões de endotoxina que suportam a escala da análise, os controles positivos do produto e os controles negativos. Todos os valores do teste necessitam ser determinados pelas amostras duplicadas, pelo menos.

Método de Toxinometer: Transfira assepticamente 0,1 mL do reagente PYROSTAR™ ES-F para os tubos do toxinometer livres de endotoxinas. Adicione 0,1 mL de cada amostra ou controle do produto aos respectivos tubos de ensaio, começando com o controle negativo e terminando com a maior concentração de endotoxina. Após cada adição de cada amostra ou controle do produto, misture rapidamente o conteúdo do tubo, sem fazer espuma. Coloque o tubo no Toxinometer na ordem da posição atribuída ao tubo. No fim do período de incubação, o software do Toxinometer executará a análise da regressão dos dados da curva padrão e calculará os níveis de endotoxina para cada amostra.

Veja o “Teste de Endotoxinas Bacterianas” na Farmacopeia dos Estados Unidos e consulte as seções que descrevem a curva padrão e a preparação de soluções.⁶

Cálculo da concentração de endotoxina

Durante uma reação de ECT, a turvação das soluções do teste é monitorada continuamente pelo Toxinometer. É medido o tempo necessário para uma amostra alcançar um nível determinado de absorbância de fundo. Esse tempo é mencionado no software do Toxinometer comoTg.

O software produz uma correlação linear do log (eixo-x)/log (eixo-y) do Tg de cada padrão com sua concentração correspondente de endotoxina. Um exemplo de uma série padrão e nível de contaminação de endotoxina de 1,0 EU/mL no produto é apresentado abaixo:

Análise representativa

NR= Não reativo

Neste exemplo, o controle positivo do produto (PPC) para cada amostra do produto resultou no nível de endotoxina consistente com o nível contaminado, indicando que não há nenhum realce ou inibição detectável no produto. O controle negativo do produto (NPC) e o controle negativo (NC) mostraram níveis significativamente mais baixos de endotoxina do que a concentração padrão mais baixa de endotoxina.

Características de desempenho

A linearidade da curva padrão dentro da escala de concentração usada para determinar os níveis de endotoxina deve ser verificada. Nada menos do que 3 padrões de endotoxina, na escala de concentração desejada, e branco de reagente da AR devem ser testados triplamente, pelo menos. Consulte a Verificação dos Critérios para a Curva Padrão da USP. O valor absoluto do coeficiente da correlação, lrl, deve ser superior ou igual ao valor de 0,980.⁶

Procedimento das técnicas de GEL-CLOTE

Para assegurar a precisão e a validação do teste PYROSTAR™ ES-F, a sensibilidade indicada na etiqueta deve ser verificada, como descrito no teste de endotoxinas bacterianas da USP <85>.⁶

Cada teste deve incluir NC (controle negativo), 2λ PC (controle de 2λ CPE), 2λ PPC (2λ controle positivo do produto) e o produto a ser testado, onde λ é a sensibilidade do PYROSTAR™ ES-F.

1. Adicione 0,1 ml do PYROSTAR™ ES-F reconstituído a cada tubo do ensaio.

2. Transfira assepticamente 0,1 mL de cada amostra ou controle de produto para cada tubo de ensaio, começando com o controle negativo e terminando com a maior concentração de endotoxina.

3. Misture rapidamente o conteúdo dos tubos e incuba-os, mantendo-os em repouso em um bloco de aquecimento ou banho-maria de 37 ± 1°C por 60 minutos ± 2 minutos.

4. Após a incubação, examine cada tubo para ver se tem gelificação. Cada tubo no método de gel-clote é interpretado como positivo ou negativo. Um teste positivo é definido como a formação de um gel firme capaz de manter sua integridade quando o tubo de ensaio é invertido a 180°. Um teste negativo é caracterizado pela ausência do gel ou pela formação de uma massa viscosa que não segura quando o tubo de ensaio é invertido.

5. Os resultados do teste só são válidos quando o 2λ PC e o 2λ PPC são positivos, e o NC é negativo.

Teste de endotoxina por diluição em série

A sensibilidade indicada na etiqueta do PYROSTAR™ ES-F pode ser confirmada preparando-se uma série de 2 de diluição de RPE ou de CPE (com uma potência confirmada) que suporte a sensibilidade indicada. A diluição em série deve ser testada 4 vezes (quadruplicada) e incluir controles negativos. A sensibilidade é então determinada calculando-se a média geométrica dos pontos finais. Um exemplo de PYROSTAR™ ES-F com uma sensibilidade de 0,125 EU/mL (λ) informada na etiqueta é descrito abaixo:

Resultados do ensaio pelo método de gel-clote

Diluição de Endotoxinas (EU/mL)

Replique        0,25          0,125        0,06          0,03    NC      (log)          Ponto final₁₀      

1                      +               +         +               -          -          0,06                -1,222

2                      +               +         -                -          -          0,125              -0,903

3                      +               +         -                -          -          0.125              -0,903

4                      +               +         +               -          -          0,06                -1,222

Converta cada ponto final do teste quadruplicado ao seu valor do log ₁₀. Os valores individuais de log₁₀ têm sua média calculada e a sensibilidade do PYROSTAR™ ES-F é medida como o antilog₁₀ deste valor médio do log. A média do log₁₀ no exemplo acima é -1,063 e a média geométrica (antilog₁₀) é 0,087.

Determinação da endotoxina em uma solução desconhecida pelo método de gel-clote

Para determinar a concentração de endotoxina de uma solução desconhecida, teste 2 vezes as diluições do produto até que um ponto final seja alcançado. Calcule a média geométrica do fator de diluição e multiplique-o pela sensibilidade à endotoxina indicada na etiqueta.

Concentração de Endotoxina = 0,125 EU/mL vezes 11,3 = 1,4 EU/mL

Bibliografia

1. Cooper, J.F., Levin, J., and Wagner, H.N. “Quantitative Comparison of in Vitro and In Vivo Methods for Detection of Endotoxin” J. Lab, Clin, Med., 78, p.128 (1971).

2. Hochstein, H.D. “The LAL Test versus the Rabbit Pyrogen Test for Endotoxin Detection; Update ’87.” Pharm. Technol., 11(6), p. 124 (1987).

3. Levin, J. and Bang, F.B. “Clottable protein in Limulus: Its Localization and Kinetics of its Coagulation by Endotoxin.” Thromb. Dieth. Haemonti., 19, p. 186 (1966).

4. Tai, J.Y. and Llu. T.Y. “Studies on Limulus Lysate, Isolation of Pro-clotting Enzyme.” J. Biol, Chem., 252, p.2176 (1977).

5. Guideline on Validation of the Limulus Amebocyte Lysate Test as an End-Product Endotoxin Test of Human and Animal Parenteral Drugs, Biological Products and Medical Devices. U.S. Dept. of Health & Human Services, FDA, December 1987.

6. “Bacterial Endotoxins Test.” The United States Pharmacopeia, most current version.  U.S. Pharmacopeial Convention, Rockville, MD.

7. Cooper, J.F., Weary, M.E., and Jordon, J,T. “The Impact of Nonendotoxin LAL-Reactive Materials on Limulus Amebocyte Lysate Analysis.” L. Parent, Sci $ Tech, 51(1), (1966).

8. Tsuchiya, M., Oishi, H., Takaoka, A., Fusamoto, M. and Matsuura, S. “Discrimination between endotoxin and (1 – 3) beta-D-glucan using turbidimetric kinetic assay with Limulus amebocyte lysate.” Chem Pahrm Bull (Tokyo), 38(9). p. 2523 (1990).

Fabricado por:

Wako Chemicals USA, Inc.

LAL Division

1600 Bellwood Road

Richmond, VA 23237

Licença No.: 1762