Prós e Contras de Diferentes Leituras de Detecção de Endotoxinas

As endotoxinas bacterianas, quando entram na corrente sanguínea humana, podem atuar como pirogênios poderosos que levam à febre, inflamação e, em casos graves, choque séptico. As bactérias Gram-negativas, que podem ser encontradas em todo o ambiente, contêm endotoxinas na sua membrana externa.

O ensaio LAL, que é o teste universalmente aceito para detectar endotoxinas, é aprovado por órgãos reguladores em todo o mundo e incluído na ‘Farmacopeia Internacional’.^[1]Para cumprir a norma ANSI/AAMI ST108:2023, a Água Crítica usada para reprocessamento, esterilização e enxágue deve garantir que o nível de endotoxina permaneça abaixo de 10 UE/ml. Além disso, testes mensais são necessários para a conformidade com esta norma.^[2]

Métodos de Detecção de Endotoxinas do Ensaio LAL

Método de Gel-coágulo LAL

O teste de Gel-coágulo do Lisado de Amebócito Limulus (LAL) recebeu aprovação da Food and Drug Administration (FDA) durante a década de 1970 e desde então tem sido amplamente adotado como a técnica autorizada para detectar endotoxinas bacterianas.^[3]

O método de gel-coágulo LAL, utilizando kits de teste único e multitestes PYROSTAR™ ES-F, representa a abordagem mais direta entre os métodos LAL, oferecendo sensibilidades que variam de aproximadamente 0,015 a 0,25 UE/mL.

O método de gel-coágulo é considerado o teste LAL mais sensível e preciso, com menos falsos positivos e menor vulnerabilidade à interferência em comparação com outros métodos. 

É, no entanto, um processo demorado. Além disso, os resultados podem ser influenciados por fatores como desequilíbrio de pH, a presença de inibidores químicos como ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), a viscosidade da substância, agentes desnaturantes como um ácido ou base forte, um sal inorgânico concentrado ou um solvente orgânico e compostos alcoólicos básicos.^[4]

Ensaios Cinéticos LAL: Método Cromogênico e Método Turbidimétrico

Os ensaios cinéticos podem ser conduzidos usando métodos cromogênicos e turbidimétricos, em que o desenvolvimento de cor ou turbidez é medido ao longo do tempo de incubação. Estes ensaios são de natureza quantitativa.

As técnicas são reconhecidas nas farmacopeias de vários países, como Europa, Estados Unidos, Japão e China, para a identificação da atividade de endotoxinas em água e produtos farmacêuticos.^[5]

Ensaio Cromogênico

A série Limulus Color KY da FUJIFILM Wako inclui o kit de teste único Limulus Color KY para uso no sistema de medição Toxinometer® e o kit multiteste Limulus Color KY que pode ser utilizado no Toxinometer® ou em um leitor de microplacas.

Esses testes quantitativos, cinéticos e cromogênicos têm uma sensibilidade extremamente alta com um limite de detecção de faixa quantitativa de 0,0002 UE/mL para o formato de teste único e 0,0005 UE/mL para o formato de teste múltiplo. Eles também incluem reagentes específicos para endotoxinas e permitem a capacidade de realizar testes de LAL de alto rendimento ao utilizar a plataforma de microplaca.

O método cromogênico LAL automatizado economiza tempo, permite que mais testes sejam concluídos e é conhecido por sua natureza amigável e processo de cálculo simples. ^[4]

No entanto, os resultados podem diferir devido às diferenças significativas no coeficiente de variação (CV), que avalia a precisão dos testes. A sensibilidade do teste indica que a interferência pode causar problemas. Tal interferência pode surgir de substâncias que desnaturam proteínas, se ligam à endotoxina ou levam à precipitação.

Ocasionalmente, amostras como serina proteases podem mudar de cor após a reação com o LAL, o que pode interferir nos resultados do teste. ^[4]

Ensaio Turbidimétrico

O método turbidimétrico mede o tempo necessário para a mistura de reação atingir um nível predeterminado de absorbância ou transmissão ou a taxa de desenvolvimento de turbidez.^[6]. É uma extensão automatizada do teste de gel-coágulo O reagente LAL modificado reduz o coagulogênio, levando a uma mistura turva que não coagula quando exposta à endotoxina.

A FUJIFILM Wako oferece três kits KTA: teste único PYROSTAR™ ES-F para o Toxinometer®, multiteste PYROSTAR™ ES-F para o Toxinometer® e PYROSTAR™ ES-F/Placa para o Leitor de Microplacas, todos específicos para endotoxinas.

Os kits de teste único e multiteste PYROSTAR™ ES-F, usados no sistema de medição Toxinometer®, aumentaram a sensibilidade com uma faixa de 0,001-10 UE/mL. O kit PYROSTAR™ ES-F/Placa, que permite o envolvimento em testes LAL de alto rendimento, tem uma faixa quantitativa de 0,01-10 UE /mL.

Ao utilizar o método turbidimétrico em vez do método de gel-coágulo mais simples, pode-se obter um resultado quantitativo, revelando o nível preciso de endotoxina na solução de amostra.

No entanto, a eficácia do método turbidimétrico no teste de sangue, plasma, soro e materiais semelhantes pode ser comprometida devido à sua maior vulnerabilidade a falsos positivos causados pela interferência de produtos suspensos ou turvos. ^[4]

Resumo

É crucial avaliar a adequação de cada Método de Detecção de Endotoxina do Ensaio LAL, pois cada método tem seus próprios pontos fortes e fracos. Técnicos que foram treinados nesses métodos podem minimizar o impacto da interferência e evitar resultados falsos.

Apesar das desvantagens associadas a essas abordagens, elas ganharam aceitação global e desempenham um papel vital na proteção do bem-estar do paciente.

Referências

1. Mehmood, Y., What Is Limulus Amebocyte Lysate (LAL) and Its Applicability in Endotoxin Quantification of Pharma Products. 2019.
2. Vockley, M.J.J.o.C.E., AAMI Publishes First National Standard on Water Quality for Medical Device Processing. 2024. 49(1): p. 30-31.
3. Meisel, J., Determination of Pyrogens: Comparison of Different Methods. Altex, 1995. 12(2): p. 89-92.
4. Wheeler, A., Comparing Endotoxin Detection Methods. Pharmaceutical Technology, 2017. 41(11): p. 58-62.
5. Flórez, P., et al., Intralaboratory Validation of a Kinetic Turbidimetric Assay Based on Limulus Amebocyte Lysate (LAL) for Assessing Endotoxin Activity in Cow Milk. Animals (Basel), 2023. 13(3).
6. Healthcare, E.D.f.t.Q.o.M.a., Farmacopeia Europeia 2016: Estrasburgo, Conselho da Europa.