Uso do Método Turbidimétrico no teste LAL

O método turbidimétrico é um dos métodos usados para a detecção do ponto final quando a análise de endotoxinas é feita usando o teste do lisado de amebócitos Limulus (LAL). Aplicando o método turbidimétrico, o teste LAL pode ser realizado de maneira semiquantitativa ou quantitativa.

O teste de LAL mede a turbidez formada em uma dissolução pela reação de coagulação que acontece quando os amebócitos extraídos do caranguejo Limulus Polyphemus entram em contato com endotoxinas bacterianas. As endotoxinas provocam o começo de uma cascata de reações que provocam a precipitação de proteínas sob a forma de gel. As endotoxinas bacterianas são patógenos muito perigosos, por isso é importante realizar este teste em todos os produtos farmacêuticos, alimentos ou qualquer outro tipo que esteja em contato com seres humanos ou animais e possa causar intoxicação por endotoxinas. As bactérias gram-negativas são aquelas que liberam endotoxinas ao romper as suas paredes celulares quando são atacadas pelos mecanismos de defesa de humanos e animais. Os altos níveis de citosinas no sangue que resultam na ativação dos sistemas de defesa podem causar condições respiratórias severas, processos inflamatórios e sepse generalizada.

A turbidimetria é um tipo de medição óptica baseada na medição da perda de transparência que as soluções têm quando aparecem partículas suspensas. Esta técnica analítica permite medir a concentração do analito responsável pela turbidez através da perda da transmissão da luz que atravessa a solução. À medida que a concentração do analito aumenta, uma quantidade maior de radiação é dispersa e/ou absorvida, de modo que diminui a intensidade da luz medida pelo detector. O equipamento utilizado para medir a luz que atravessa a amostra nessas análises é um espectrofotômetro, ou turbidímetro, que são espectrofotômetros especializados na medição de turbidez. Ambos equipamentos são relativamente baratos e, quando aplicados em diversos testes, estão disponíveis na maioria dos laboratórios de pesquisa. Por exemplo, métodos turbidimétricos são usados em laboratórios de microbiologia para controlar o crescimento de uma população de células.

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Ao aplicar a turbidimetria ao ensaio de LAL, podem ser feitas medições quantitativas da quantidade de endotoxinas presentes em um meio, que é proporcional à turbidez gerada. A análise de LAL, utilizando turbidimetria, pode ter como método de detecção o método turbidimétrico do ponto final ou o método turbidimétrico cinético. No ensaio turbidimétrico do ponto final, a turbidez é lida num determinado momento após o reagente que contém o lisado entrar em contato com a amostra. Como principal desvantagem do método pode-se mencionar os erros de manipulação que são bastante frequentes e afetam os resultados e a necessidade de repetir todo o processo desde o início, caso seja cometido algum erro que afete a leitura, pois há um único momento para realizar a medição e deve ser preciso. Se a turbidez não for lida no momento indicado, a gelificação continua e leva a erros no cálculo das concentrações de endotoxina, portanto, o método do ponto final não é usado com frequência.

O método turbidimétrico cinético, por outro lado, é o escolhido na maioria dos casos em que o teste de LAL precisa ser feito quantitativamente. A vantagem mais importante desse método é a possibilidade de utilizar leitores de placas acoplados a computadores que permitem a leitura automatizada; um erro que induza um ponto de leitura errôneo não provoca a necessidade de refazer toda a análise, este ponto pode ser descartado ao fazer os cálculos; um baixo limite de detecção pode ser alcançado e detectar endotoxinas em uma ampla gama de concentrações. Para construir as curvas de calibração e as curvas de medição do teste de LAL usando este método, os valores dos antilogaritmos da variável tempo e os antilogaritmos da concentração são usados e linhas retas são obtidas em toda a faixa de aplicação da Lei de Lambert Beer. Para obter boa reprodutibilidade e precisão nos resultados, é necessário controlar a temperatura do teste e trabalhar na temperatura indicada pelo fabricante dos reagentes.

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