Deteção de endotoxinas mediante o ensaio LAL: Método Gel-Clot

O ensaio de lisado de amebócitos de Limulus é recomendado pelas empresas farmacêuticas internacionais como método de determinação de toxinas bacterianas tanto em matérias-primas utilizadas para produção de medicamentos como para testar produtos finais.

Este ensaio também é útil para a indústria cosmética e na confeção de alimentos, sendo o método aconselhado pela FDA (Food and Drug Administration) para a deteção de pirogéneos.

Já há algumas décadas que se realiza um esforço pela parte da comunidade científica e da sociedade em geral para minimizar o uso de animais em ensaios laboratoriais. Uma das principais vantagens do ensaio LAL assenta em que os caranguejos dos quais se extrai a hemolinfa para preparar o reagente LAL continuam vivos. Este feito contribui para que o ensaio de LAL substitua em grande escala o método de deteção de pirogéneos através de controlos da febre do coelho.

Endotoxinas bacterianas

As bactérias Gram negativas têm a sua membrana externa formada por lipopolissacáridos, esta estrutura é tóxica para outros organismos superiores, como os animais e os homens. Estes lipopolisacáridos são conhecidos como endotoxinas para serem diferenciados de outras toxinas que as bactérias possam secretar sem que, contudo, façam parte da sua estrutura, chamadas exotoxinas. Quando as bactérias se multiplicam ou se destroem, parte destas endotoxinas passam para o meio, exercendo a sua função patogénica.

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O mecanismo de toxicidade que as endotoxinas desencadeiam é causado pela fração lipídica dos lipopolisacáridos. Por exemplo, ao dar-se a lise das bactérias dentro de um organismo, a resposta face aos lípidos que passam à corrente sanguínea pode dar-se através da ativação do sistema de complemento. Esta fração lipídica origina a libertação de diferentes citoquinas como as interleucinas 1 e 8, ativando-se também provavelmente o fator de necrose tumoral. A infeção desencadeada está associada a processos inflamatórios e pode representar grande perigo para o organismo infetado. As interleucinas 1 são uma série de citoquinas que o organismo liberta como resposta imune e face à inflamação. Este sinal promove a migração de neutrófilos ao local onde ocorreu a infeção, desencadeando-se a quimiotaxia. Isto facilita a ocorrência da fagocitose, no entanto em alguns casos, dependendo do estado do sistema imunitário do indivíduo e do grau da infeção, as bactérias podem chegar a provocar uma sepsis generalizada, com todos os riscos que isto representa. Conhecem-se muitos casos em que as bactérias Gram negativas causaram a morte por infeção sistémica em mamíferos superiores.

Entre as bactérias Gram negativas encontram-se algumas muito conhecidas como a Salmonella e a Escherichia coli e outras que nem tanto como a Shigella e a Neisseira.

Ensaio de lisado de amebócitos de Limulus

O caranguejo Limulus polyphemus é um dos animais que há já mais tempo sobrevive na terra, as suas origens datam de há mais de 200 milhões de anos. Este animal tão resistente é capaz de sofrer coagulação da sua hemolinfa devido à presença de endotoxinas bacterianas. Ao descobrir-se este acontecimento na década de 60, continuaram-se as investigações até ser possível aproveitar esta reação para realizar ensaios in vitro de deteção de endotoxinas em diferentes meios. O Limulus polyphemus pertence ao grupo dos caranguejos ferradura, sendo também conhecido como o caranguejo baioneta. Este caranguejo habita na costa atlântica, desde a parte mais a norte do continente americano até ao golfo do México.

Os responsáveis pela coagulação da hemolinfa dos caranguejos Limulus polyphemus são os amebócitos, os principais componentes da hemolinfa deste animal. Os amebócitos cumprem nos invertebrados um papel semelhante ao dos glóbulos brancos dos vertebrados, defendendo o organismo de agentes patogénicos e libertando uma série de enzimas como resposta a endotoxinas provenientes das bactérias. Os investigadores estudaram este fenómeno até conseguirem comprovar que ao diluir um lisado dos amebócitos extraídos do caranguejo ferradura em meio aquoso, podem ser detetadas quantidades muito pequenas de endotoxinas.

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Os amebócitos contêm enzimas pro-coagulantes que desencadeiam uma cascata de reações. O produto final destas reações em cadeia é um gel composto por proteínas coaguladas. A resposta enzimática é produzida ao contato dos amebócitos com as endotoxinas. Este mecanismo é comparado frequentemente como o da tripsina que também desencadeia uma cascata de reações para finalmente formar a trombina, responsável pela coagulação do sangue em humanos.

O ensaio LAL só é válido para a deteção de endotoxinas e não de qualquer outro pirogéneo (nome utilizado para designar qualquer composto capaz de produzir febre). Em muitas ocasiões é utilizado este ensaio com o intuito de detetar outros pirogéneos erroneamente. Apesar das endotoxinas bacterianas serem dos pirogéneos que mais prevalecem após aplicação de medidas de sanitização comuns nas indústrias, por serem muito resistentes ao calor e aos diferentes reagentes químicos utilizados na esterilização, um ensaio LAL negativo apenas indica a ausência de endotoxinas, não a de outros microrganismos pirogénicos. A realização deste ensaio apenas conduz à confirmação de que o meio se encontra livre de pirogéneos quando é acompanhado de outras análises e medidas sanitárias específicas para erradicar o resto dos microrganismos contaminantes.

Para o uso do ensaio de LAL deve ser realizada uma validação para o processo industrial específico em que será aplicado. A FDA regula as validações deste ensaio, encontrando-se muitos registos na literatura deste procedimento, sobretudo para os fármacos injetáveis.

Método de Gel-Clot para quantificar endotoxinas mediante o ensaio de LAL

O ensaio de LAL pode ser realizado utilizando diferentes métodos para avaliar o processo de gelificação que ocorre como resposta dos amebócitos às endotoxinas. Estas técnicas são chamadas de Gel-Clot, turbidimetria e métodos cromogénicos. Aqui centrar-nos-emos no método Gel-Clot ou gelificação.

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O método Gel-Clot consiste em determinar o aparecimento de um gel e a gelificação ocorre ao coagularem-se as proteínas por presença de endotoxinas. O limite de deteção dos ensaios depende do fabricante do kit que contém o reagente LAL. Normalmente, utilizando o método de Gel-Clot, o limite de deteção está entre 0.01 e 0.03 unidades de endotoxinas por mililitro de solução utilizada no ensaio. Isto significa que abaixo desta concentração de endotoxinas não se chega a formar um gel sólido que permaneça no tubo de ensaio quando é movimentado. Um critério utilizado no método de gelificação é virar o tubo de ensaio até um ângulo de 180º e comprovar que o gel se mantém intato. O método Gel-Clot pode ser utilizado de maneira qualitativa, dando resultados positivo ou negativo caso não se forme o gel, e semiquantitativa.

Divisão LAL de Wako comercializa um teste de LAL que funciona tendo por base o método de Gel-Clot, o Test Limulus ES-II da Wako. Com o realizar deste teste elimina-se a interferência do β-1,3-glucano, outro polissacárido que se encontra na parede celular de bactérias e fungos e que, em pequenas quantidades pode interferir na medição das endotoxinas. Este teste contém já o β-1,3-glucano numa maior concentração que aquela existente nos meios em que se realiza a análise de endotoxinas, uma vez que este composto em altas concentrações já não desencadeia as reações que conduzem à formação da coagulina. O uso deste teste está restringido para a investigação, o procedimento é simples mas, no entanto, deve ser realizado com muita precaução para evitar contaminações das amostras. Depois de incubar os tubos em que se realiza o ensaio a 37ºC, durante uma hora, vira-se a boca dos mesmos para baixo para comprovar se se formou ou não o gel. Este ensaio é qualitativo.

Além do Test Limulus ES-II, a Wako fornece aos investigadores uma linha especializada de acessórios e reagentes para LAL. Entre os produtos oferecidos encontram-se a Controle Padrão de Endotoxina, a solução para a extração de endotoxinas e um toxinometer, assim como outros testes desenhados para a determinação de endotoxinas por métodos cromogénicos.

LINHA DE PRODUTOS LAL

Kit de 4 PYROSTAR™ ES-F (2,0 mL) com (CPE)	Toxinometer Série ET-6000	Kit de 100 PYROSTAR™ ES-F (2,0 mL) (sem CPE)