Deteção de endotoxinas mediante o ensaio de LAL, método cromogénico

A deteção de endotoxinas por LAL (lisado de amebócitos de Limulus) é uma técnica que se utiliza diariamente nos laboratórios de investigação, sobretudo naqueles em que se investigam temas biológicos e, mais especificamente, nos de biomedicina. Esta técnica está também amplamente difundida por toda a indústria farmacêutica, onde é empregue para comprovar que os medicamentos não contêm endotoxinas na sua formulação final e está aprovada pela maioria das empresas farmacêuticas como prova padrão do controlo de pirogénicos. Também é utilizada para controlo de outros meios suscetíveis a contaminação com endotoxinas bacterianas, por exemplo é muito útil no controlo de qualidade de alimentos e da água. Já foi discutido, em artigos anteriores, os métodos de gelificação e turbidimétricos usados na técnica de LAL. No presente artigo focar-nos-emos no método cromogénico como forma de quantificar as endotoxinas bacterianas presentes num meio.

Métodos cromogénicos de análise

São conhecidos como métodos cromogénicos as técnicas de análise ótica que permitem medir a presença de um analito (análise qualitativa) e a sua concentração em diferentes meios (análise quantitativa), mediante alterações de coloração. A maioria dos compostos químicos são capazes de interagir com a luz tendo como resultado um sinal analítico facilmente aferido. Os métodos óticos de análise dividem-se segundo as suas alterações se produzem no espectro eletromagnético, os métodos espectroscópicos, ou na direção da propagação da luz, métodos não espectroscópicos.

Os métodos óticos espectroscópicos agrupam tanto aqueles processos baseados na absorção da luz, onde se encontram os designados métodos colorimétricos ou cromogénicos, como os que se relacionam com a emissão de luz, fluorescência, emissão de raios X e fosforescência, por exemplo. Para estudar os processos de absorção de luz utiliza-se um espectrofotómetro, com o qual se pode medir tanto a luz transmitida como a absorvida, segundo seja mais conveniente para o utilizador. É mais comum realizar as medidas de absorvância que, segundo estabelece a Lei de Lambert Beer, é proporcional à concentração da espécie (ou espécies) absorventes que se encontram em solução.

A radiação eletromagnética visível é aquela cujo comprimento de onda se encontra entre os 380 nm e os 770 nm. Os métodos cromogénicos de análise baseiam-se no uso de substâncias que absorvem luz neste intervalo do espetro eletromagnético e que conhecemos como corantes. Existem muitos compostos que têm o seu máximo de absorção na região visível, que compreende do violeta ao vermelho. A banda de absorção de um corante muda de intensidade proporcionalmente à concentração dessa substância no meio.

VER TAMBÉM: A necessidade de testes LAL para a deteção de endotoxinas

Ensaio de lisado de amebócitos de Limulus utilizando métodos cromogénicos de deteção de endotoxinas

O método de deteção de endotoxinas bacterianas que utiliza o lisado de amebócitos de Limulus (LAL) foi desenvolvido na década de 60 do século passado e, desde esse momento, tem-se vindo a confirmar uma ferramenta muito útil na investigação e na indústria. Já desde princípios do século conhecia-se que a hemolinfa do caranguejo Limulus Polyphemus sofria um processo de coagulação. Mais tarde descobriu-se que a coagulação da hemolinfa era causada por bactérias Gram negativas que provocam o desencadear de uma série de reações enzimáticas em cascata. Estas reações enzimáticas ocorrem nos amebócitos, devido à presença de endotoxinas que constituem a parede celular das bactérias Gram negativas e originam, como resultado, a formação de coagulina, proteína causadora do processo de coagulação.

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Posteriormente, as investigações sobre a cascata de reações enzimáticas que se produz nos amebócitos de Limulus concluíram que estas reações são capazes de cisar ligações de péptidos que se encontram unidos a moléculas de p-nitroanilina. Ao libertar-se a p-nitroanilina, que é um corante amarelo, altera-se a tonalidade da solução. Adicionando um péptido unido à p-nitroanilina ao lisado de amebócitos de Limulus, reagente do ensaio de LAL, quando há endotoxinas no meio, a solução toma uma certa tonalidade, pelo que se pode detetar a presença de endotoxinas através de um método cromogénico. Neste caso torna-se necessário a utilização de um espectrofotómetro para quantificar a concentração de corante libertado como produto da reação enzimática. Este método de deteção pode aparentar ser dispendioso pela necessidade de um espectrofotómetro, no entanto não o é se se entrar em linha de conta que, em qualquer laboratório, o espectrofotómetro tem um uso variado e que, assim sendo, não é necessário nenhum equipamento especial para este ensaio.

Para se desenvolver a deteção de endotoxinas bacterianas pelo método cromogénico no ensaio de LAL, existem 2 vertentes: o método cromogénico de ponto final ou o método cromogénico cinético. O método cromogénico cinético baseia-se na medição da cor em diferentes intervalos de tempo depois de adicionado o reagente de LAL, que contém o reagente cromogénico, à solução que pode apresentar endotoxinas. As vantagens deste método são diversas: pode ser totalmente automatizado, permite a medição de muitas amostras num curto período de tempo e os resultados são facilmente processados. A principal desvantagem é que muitas substâncias podem causar interferência: aquelas que absorvem ao redor de 400 nm, que é a zona onde se encontra a banda de absorção da p-nitroanilina, as que formam quelantes ou as que desnaturam proteínas, etc. Além disso, há que evitar que a solução esteja turva para se poder realizar a medição sem erros que possam produzir turbidez no dado da absorvância que se obtém.

O método cromogénico de ponto final, como o próprio nome indica, mede o aparecimento de cor uma vez terminada a reação enzimática. Segundo o fabricante do kit de ensaio de LAL, a reação considera-se terminada ao finalizar o período de incubação ou depois da solução acidificar. Utilizando qualquer destas duas opções, este método apresenta uma desvantagem relativamente ao ensaio cinético, o facto de apenas se realizar uma única medição por cada solução da amostra. À semelhança do método turbidimétrico de ponto final, se a medida estiver errada por um qualquer motivo há que repetir o ensaio. No método cromogénico cinético recolhem-se várias medidas de absorvância em diferentes instantes, pelo que o erro numa determinada medida não determina que se tenha de realizar novamente todo o ensaio, pode-se obter um resultado fiável ignorando um ponto da curva. No entanto, o método cromogénico de ponto final tem a vantagem de que em amostras em que possam existir interferências na zona onde a p-nitroanilina absorve, podem-se formar derivados desta substância e assim obter outro corante numa zona em que a medição seja mais reproduzível. Por exemplo, existem testes de LAL que utilizam a formação de um determinado azo-composto da p-nitroanilina para realizar a medida por cima dos 500 nm, zona em que, supostamente, existem menos interferências e, além disso, a formação do azo-composto permite diminuir o limite de deteção do ensaio, pois os azo-compostos têm bandas com um maior coeficiente de extinção do que a p-nitroanilina.

Também se pode utilizar o método cromogénico de ponto final para a análise qualitativa de endotoxinas mediante o ensaio de LAL. O aparecimento de cor observa-se a olho nu, requerendo um menor tempo de incubação do que o do método de gelificação, que é o mais frequentemente utilizado para a análise qualitativa da presença de endotoxinas. Além disso, evita os possíveis erros que se podem cometer com o ensaio do método da gelificação por rotura do gel, antes ou durante a medição.

Test Limulus Color KY para a deteção de endotoxinas

O Test Limulus Color KY comercializado pela Wako está desenhado para determinar de maneira quantitativa a quantidade de endotoxina bacteriana presente numa dada amostra. Ao provocar uma reação entre a endotoxina com o lisado de amebócitos de Limulus liberta-se um cromóforo que é o responsável pela coloração da amostra e que permite a deteção colorimétrica. A quantidade de endotoxina presente é proporcional à quantidade de cromóforo libertado e, portanto, à intensidade da banda de absorção responsável pela cor.

Este teste foi utilizado em diversos trabalhos de investigação desde que começou a ser comercializado. Como exemplos podemos mencionar as seguintes investigações:

• Em estudos sobre a inativação da neumolisina, toxina proveniente do Streptococcus pneumoniae e causadora de afeções como a pneumonia e a meningite. H. Baba e colaboradores, no trabalho titulado “Induction of Gamma Interferon and Nitric Oxide by Truncated Pneumolysin That Lacks Pore-Forming Activity”, utilizaram o test Limulus Color KY para comprovar que a neumolisina recombinante sintetizada estava livre de endotoxinas. (Infect Immun. Jan 2002; 70 (1), 107–113.)

• No caso de Nakano T. e colaboradores utilizou-se o Test Limulus Color KY da Wako para comprovar que os anticorpos utilizados nos seus estudos relativos ao papel dos neutrófilos nos mecanismos de defesa do sistema imunitário não estavam contaminados com endotoxinas. (Activation of neutrophils by a novel triggering immunoglobulin-like receptor MAIR-IV, Mol Immunol. 2008 Jan; 45 (1), 289-94.)

• C. Kohda e colaboradores também fizeram uso do Test Limulus Color KY para comprovar que diferentes fragmentos de listeriolisina O sintetizados estavam livres de endotoxinas. Neste caso, apesar de a listeriolisina O ser proveniente da bactéria Listeria monocytogenes, que é Gram positiva, para estudar os seus efeitos tóxicos para o organismo era necessário assegurar que as moléculas utilizadas nos ensaios não continham endotoxinas. (Dissociated Linkage of Cytokine-Inducing Activity and Cytotoxicity to Different Domains of Listeriolysin O from Listeria monocytogenes, Infect. Immun. 2002, 70 (3), 1334.)

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