Como evitar a interferência de nanopartículas no teste LAL?

Certos avanços tecnológicos recentes têm permitido o uso de nanomateriais na biologia e na medicina. As nanopartículas possuem propriedades físico-químicas que oferecem novas estratégias para o tratamento de doenças. No entanto, esses nanomateriais têm o potencial de causar respostas imunes perigosas, devido à presença de endotoxinas bacterianas.

As endotoxinas são lipopolissacarídeos grandes e termoestáveis encontrados na membrana externa das bactérias gram-negativas. Quando o sistema imunológico inato é exposto a endotoxinas, pode produzir um choque séptico com risco de morte. Por esse motivo, o FDA exige que todos os medicamentos e dispositivos médicos tenham níveis de endotoxina abaixo desse limite regulamentado.

De acordo com um relatório,a maioria dos nanomateriais disponíveis comercialmente estão contaminados por endotoxinas. Isso representa um desafio para o novo campo da nanotoxicologia, que deve diferenciar a toxicidade intrínseca de um nanomaterial, da toxicidade produzida pela contaminação.

O teste LAL (Lisado de Amebócito Límulus) é o método mais popular de detecção e quantificação de endotoxinas. Depende das células sanguíneas (amebócitos) do caranguejo-ferradura. Após o contato com endotoxinas, uma cascata química induz a coagulação como mecanismo de defesa contra a infecção. O teste LAL  utiliza esta reação de coagulação para quantificar os níveis de endotoxinas.

No entanto, vários estudos têm mostrado que as nanopartículas podem interferir com teste LAL, o que produz uma estimativa de excesso ou insuficiência para os níveis de endotoxinas. Em alguns casos, as nanopartículas podem interagir com enzimas nas reações de coagulação. Também é possível que a densidade óptica das nanopartículas interfira com as leituras do solvente de LAL, em particular com o método cromogênico.

Para evitar esses problemas, é importante considerar cuidadosamente qual método LAL é o mais confiável, dependendo das propriedades intrínsecas do nanomaterial. Um dos métodos LAL mais comuns (gel-clot, turbidimétrico e cromogênico), o método cromogênico, é geralmente considerado o mais resistente à interferência de nanopartículas. Este método utiliza um substrato colorido formado pela reação de coagulação das endotoxinas.

No entanto, nanopartículas com alta densidade óptica também podem interferir no método cromogênico. Um método alternativo nesses casos é o método turbidimétrico, que mede a turbidez da solução LAL. Com esse método, as nanopartículas com alta concentração devem ser evitadas, pois aumentam a turbidez da solução e alteram os resultados do teste.

Após selecionar o melhor método, controles apropriados devem ser usados para normalizar os resultados. Para minimizar as interferências, as nanopartículas devem ser diluídas antes da quantificação das endotoxinas. A diluição máxima válida depende da sensibilidade do reagente LAL usado.

A série Limulus Color KY da FUJUFILM Wako é uma opção robusta para a detecção de endotoxinas em amostras com nanopartículas. Este kit em particular, que utiliza um método cromogênico, é mais resistente à interferência de nanopartículas.

Além disso, o kit é muito sensível, com um limite de detecção quantitativa de 0,0002 UE/ml (tipo único) ou 0,0005 UE/ml (tipo múltiplo). Isso permite uma alta diluição válida máxima, o que minimiza ainda mais o risco de interferência.

Para nanopartículas com alta densidade óptica, pode ser usada a série PYROSTAR™ ES-F. Esses kits dependem de uma leitura turbidimétrica e têm um alcance de detecção muito baixo de 0,001 UE/ml.

REAGENTES LAL:

Solução extratora de endotoxina	Kit de 4 PYROSTAR™ ES-F (5,2 mL) com CPE	PYROSTAR ES-F Plate com CPE