Uso do método Gel-Clot no teste de LAL

O teste de LAL (lisado de amebócitos Limulus) é usado para determinar a presença de endotoxinas bacterianas de amostras biológicas ou de outros tipos; esta análise pode ser realizada usando para a detecção, o método Gel-Clot ou Gelificação, já que um gel é formado se o teste for positivo.

As bactérias podem causar toxicidade devido a substâncias exógenas, que são chamadas de exotoxinas, e a substâncias endógenas, as endotoxinas. É conhecido como endotoxinas bacterianas os lipopolissacarídeos que fazem parte da parede celular de bactérias Gram-negativas e que, quando a membrana é rompida, são liberados no meio ambiente, causando alta toxicidade em mamíferos e outros animais. A causa da toxicidade dos lipopolissacarídeos é a fração lipídica destas moléculas, cuja estrutura pode variar em diferentes tipos de bactérias. Ao passar a fração lipídica para a corrente sanguínea dos animais e do homem, entre as reações que podem ocorrer está a ativação da secreção de interleucina e de fator de necrose tumoral, causando reações inflamatórias que podem ocasionar desde infecções leves até a morte do indivíduo.

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No caso do caranguejo Limulus polyphemus, a contaminação com endotoxina provoca uma série de reações que resultam na coagulação em sua hemolinfa. O princípio do teste LAL é baseado nessas reações, sendo os amebócitos as entidades que são isoladas da hemolinfa para serem utilizadas no teste, pois é nesse local que ocorre esse processo. Os amebócitos, nos invertebrados, são equivalentes aos glóbulos brancos nos vertebrados, tendo uma função protetora contra patógenos que podem prejudicar o animal. Os amebócitos contêm enzimas que desencadeiam uma cascata de reações cujo produto final é um gel composto de proteínas coaguladas. O teste LAL tornou-se o teste de referência para a detecção de pirogênios na indústria, devido às endotoxinas bacterianas são os pirogênios mais abundantes.

O teste LAL pode ser feito usando diferentes métodos que indicam que o processo de gelificação está ocorrendo no meio de reação pela presença de endotoxinas. Esses métodos podem ser Gel-Clot, turbidimétricos e cromogênicos. O método Gel-Clot consiste em determinar se um gel aparece no lisado: o processo de gelificação é devido à coagulação das proteínas que provocam as endotoxinas. Este método geralmente é usado para o teste LAL, sendo o método de escolha recomendado pelo FDA, salvo indicação em contrário pelo tipo de amostra em estudo. O teste pode ser realizado pelo método de Gel-Clot, de forma qualitativa, sendo o surgimento do gel o resultado positivo do teste, ou de forma semiquantitativa, uma vez que a quantidade de gel que é formada é proporcional à concentração de endotoxinas.

Um dos principais interferentes deste teste são os β (1→3) - D-glicanos, que também são capazes de ativar a cascata de reações que leva à formação do gel, via ativação do Fator G. No mercado, existem vários kits em que o Fator G do lisado de amebócitos é extraído para evitar essa interferência. Outra possibilidade que existe para eliminar a ativação por β (1→3) - D-glicanos, é inibir a ação do Fator G. Nos kits para análise de LAL da marca PYROSTAR isto é conseguido pela adição de Curdlan, um derivado do β (1→3) - D - glicano que, em altas concentrações, inativa o fator G e, portanto, não são desencadeadas as reações que levam à formação da coagulina.

LINHA DE PRODUTOS LAL:

Água reagente LAL (LRW): Água sem endotoxina	Kit KY color Limulus	Toxinometer® Série ET-6000