Uso do Método Colorimétrico no Teste de LAL

Os métodos de análise colorimétrica permitem, através da medição da variação de absorbância de uma amostra a um determinado comprimento de onda, calcular a concentração dos analitos de interesse. Este método de detecção pode ser usado no teste de LAL (lisado de amebócitos de Limulus) para endotoxinas.

Conheça e cite online nossos Reagentes Específicos LAL para Endotoxinas AQUI

O teste de LAL é uma técnica bem conhecida pelos pesquisadores para a determinação de endotoxinas da membrana celular das bactérias Gram-negativas. Este teste foi desenvolvido na década de 1960, quando foi aproveitado o fato de que a hemolinfa do caranguejo Limulus Polyphemus sofria um processo de coagulação na presença de endotoxinas para se tornar uma técnica analítica.

 A cascata de reações enzimáticas que ocorre nos amebócitos de Limulus na presença de endotoxinas bacterianas, dá origem à formação de coagulina, que provoca a turbidez no meio de reação. Estas mesmas reações rompem as ligações peptídicas que ligam a p-nitroanilina com uma proteína, portanto, esse corante pode ser usado como um sinal de que reações de defesa estão ocorrendo no lisado de amebócitos. A p-nitroanilina livre é de cor amarela e permite o uso de um método cromogênico para a detecção de endotoxinas. Com o uso de um espectrofotômetro, a concentração de corante liberado durante as reações enzimáticas induzidas pela endotoxina é quantificada.

Também pode interessar-lhe: Uso do Método Turbidimétrico no teste LAL

Os métodos de análise óptica são simples e baratos, portanto, dependendo das características da amostra, eles são o método de escolha para a quantificação de endotoxinas. Para aplicar o método cromogênico no teste LAL para detecção de endotoxina bacteriana, a análise pode ser realizada pelo método cromogênico do ponto final ou pelo método cromogênico cinético.

O método cromogênico cinético baseia-se na medição da cor da amostra de teste em diferentes intervalos de tempo após a adição do reagente de LAL contendo a substância colorida. Como vantagem deste método, temos que ele pode ser automatizado, economizando tempo e permitindo um maior número de medições. Tem como desvantagem que não pode ser aplicado quando existem outras moléculas com cor que podem causar interferências. A banda de absorção da p-nitroanilina é de cerca de 400 nm, onde também absorvem uma grande quantidade de grupos cromóforos.

O método cromogênico do ponto final, por outro lado, baseia-se na medição da absorvância da amostra quando a reação está terminada, o que, de acordo com o kit de teste, pode ser no final do período de incubação ou quando a solução é acidificada. Embora o método seja cromogênico e ofereça as mesmas vantagens que o método cinético, ele tem a clara desvantagem de que o resultado é obtido apenas de uma medida e não de várias, como no cinético. Se a medição feita tiver um erro, não há como verificar isso mesmo replicando o teste (o que leva a um gasto maior de reagentes); portanto, há uma chance maior de obter resultados falsos. Devido a essa desvantagem, o método cromogênico do ponto final é utilizado apenas para realizar testes qualitativos ou quando, por razões de interferência, é necessário formar um derivado da p-nitroanilina liberada quando a reação é concluída. Desta forma, é possível realizar medições em amostras contendo corantes que interferem na zona de absorção da p-nitroanilina.