Top 5 dicas para reduzir a contaminação por endotoxinas no laboratório

A contaminação química ou biológica pode levar a resultados experimentais não confiáveis em laboratórios de diagnóstico e pesquisa. As endotoxinas bacterianas são um dos contaminantes mais insidiosos que podem conferir efeitos inflamatórios às amostras investigadas e mascarar suas propriedades biológicas autênticas. Endotoxinas bacterianas (lipopolissacarídeos) são pirogênios e componentes da membrana externa de bactérias gram-negativas. Elas se desprendem em pequenas quantidades durante o crescimento bacteriano e são liberadas em grandes quantidades após a morte e lise bacteriana.¹ O teste de lisado de amebócito Limulus (LAL) é o teste melhor estabelecido para a detecção de endotoxinas. É baseado na incubação de proteína extraída do sangue do caranguejo ferradura com endotoxina, levando a uma reação de coagulação que pode ser quantificada para uma avaliação precisa da endotoxina.¹

Fontes de contaminação por endotoxinas no laboratório

As fontes mais comuns de contaminação por endotoxinas no laboratório incluem água, meio de cultura celular e reagentes, soro e material plástico/vidraria. Soro fetal bovino (SFB), meio de cultura celular, E. coli- fatores de crescimento recombinantes derivados, hormônios e reagentes de dissociação são alguns dos reagentes que podem ser contaminados por endotoxinas. Notavelmente, a remoção da contaminação por endotoxinas é um desafio porque as endotoxinas são resistentes a muitos dos métodos tradicionalmente usados para descontaminação.

Consequências da contaminação por endotoxinas no laboratório

A contaminação por endotoxinas pode levar à leitura errônea da expressão do gene ou função das células ou amostras analisadas. Esse fenômeno foi observado em muitos tipos de células ou materiais diferentes e foi relacionado principalmente às propriedades pirogênicas das endotoxinas. Por exemplo, a contaminação por endotoxinas pode conferir propriedades inflamatórias aos nanomateriais, interferindo na leitura de suas propriedades biológicas autênticas.² Assim, evitar ou remover a contaminação por endotoxinas no laboratório é fundamental para garantir resultados experimentais de alta qualidade.

Aqui estão 5 etapas para reduzir a contaminação por endotoxinas no laboratório:

1. Artigos de plástico não-pirogênicos - As endotoxinas têm alta afinidade por artigos de plástico. Embora os materiais plásticos de laboratório sejam produzidos em altas temperaturas que geralmente destroem as endotoxinas, a contaminação por endotoxinas pode ser introduzida durante o manuseio e embalagem subsequentes. O uso de material plástico não-pirogênico comercialmente disponível ajudará a evitar essa fonte potencial de contaminação por endotoxina.

2. Vidraria despirogenada - Endotoxinas também podem contaminar vidraria de laboratório. Notavelmente, lavar ou mesmo autoclavar vidrarias em condições padrão não é suficiente para remover a contaminação por endotoxinas. A despirogenização com calor seco a 250°C por 30 min³ ou a 180°C por 4 h¹ demonstrou remover a contaminação por endotoxina.

3. Água de alta pureza - A contaminação da água por endotoxinas pode ocorrer devido à purificação insuficiente da água ou armazenamento em condições inadequadas. Sistemas de ultrapurificação baseados em osmose reversa ou destilação em vidro podem garantir que a água esteja livre de contaminação por endotoxinas. Além disso, a água de alta pureza deve ser armazenada apenas em recipientes não-pirogênicos, e o armazenamento prolongado deve ser evitado.

4. Soro, reagentes e meios testados para endotoxinas - Meios de cultura de células, reagentes e soros, como SFB, também podem ser uma fonte de contaminação por endotoxinas. Os soros, meios e reagentes testados com endotoxinas foram desenvolvidos comercialmente para prevenir a contaminação por endotoxinas. 

5. Descartar ou descontaminar materiais contaminados por endotoxinas - Sempre que possível, reagentes e células contaminados por endotoxinas devem ser descartados e substituídos por materiais sem endotoxinas. A descontaminação de endotoxinas pode ser realizada para materiais altamente valiosos que não podem ser substituídos. Cromatografia de afinidade e soluções baseadas em Triton X-114 têm sido usadas com sucesso para a descontaminação de endotoxinas.^4,5

A contaminação por endotoxina pode levar a resultados experimentais errôneos e não confiáveis em laboratórios de diagnóstico e pesquisa. Etapas simples, como teste de endotoxina e uso de material plástico não-pirogênico, vidro despirogenado, água de alta pureza e reagentes e meios de cultura de células testados para endotoxina evitarão a contaminação por endotoxina e garantirão a confiabilidade dos resultados obtidos.

Fontes de literatura

1. https://www.fda.gov/inspections-compliance-enforcement-and-criminal-investigations/inspection-technical-guides/bacterial-endotoxinspyrogens
2. Li Y, Boraschi D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine (Lond). 2016;11(3):269-87. doi: 10.2217/nnm.15.196. Errata em: Nanomedicine (Lond). 2016;11(6):739.
3. Sandle T. A comparative study of different methods for endotoxin destruction. Am Pharm Rev. 2013;Supplement.
4. Schneier M, Razdan S, Miller AM, Briceno ME, Barua S. Current technologies to endotoxin detection and removal for biopharmaceutical purification. Biotechnol Bioeng. 2020;117(8):2588-2609. doi: 10.1002/bit.27362.
5. Teodorowicz M, Perdijk O, Verhoek I, Govers C, Savelkoul HF, Tang Y, Wichers H, Broersen K. Optimized Triton X-114 assisted lipopolysaccharide (LPS) removal method reveals the immunomodulatory effect of food proteins. PLoS One. 2017;12(3):e0173778. doi: 10.1371/journal.pone.0173778.