Testes de Beta Glicanos e Endotoxina
A presença de endotoxinas bacterianas nos diferentes meios, soluções e em materiais de laboratório pode ser determinada utilizando o teste de lisado do amebócito limulus (LAL). Este ensaio, que é o teste de compêndio para o exame de endotoxinas bacterianas em produtos farmacêuticos, tornou-se uma ferramenta essencial para a indústria e pesquisa nas últimas décadas, e o teste mais confiável para a detecção de pirogênios.
A base bioquímica do teste de LAL envolve o mecanismo de coagulação único iniciado por amebócitos do sangue do caranguejo-ferradura do Atlântico (Limulus polyphemus) quando exposto à endotoxina de bactérias gram-negativas. Há uma cascata específica associada com o LAL que torna possível observar tanto efeitos qualitativos como quantitativos quando a endotoxina está presente. As reações enzimáticas que ocorrem ao longo desta cascata resultam na conversão do coagulogênio do amebócito em uma proteína coagulante tipo fibrinogênio, que dá forma a um gel de coagulina.1 Uma revisão mais detalhada destas reações mostra que a interação de endotoxina inicia o Fator C (primeiro precursor da serina-protease) de sua forma inativa, que ativa por sua vez o Fator B (segundo precursor da serina-protease). O Fator B ativado estimula a enzima coagulante, convertendo-a a partir de uma enzima pró-coagulante.
A enzima coagulante então cliva ligações peptídicas dentro do coagulogênio para produzir coagulina, a proteína formadora de gel insolúvel produzida no ensaio de gel-coágulo. Há, entretanto, outros compostos que causam também a gelificação do lisado de amebócito do caranguejo-ferradura, levando a uma interferência no teste de endotoxinas bacterianas. Alguns destes compostos são conhecidos como (1,3)-β-D- glicanos, que podem levar a falso-positivos no teste de LAL devido à iniciação da cascata de coagulação quando os glicanos provocam a enzima protease Fator G. Para superar esta interferência, o ensaio pode ser o modificado para incluir uma ampla gama de reagentes bloqueadores de glicano.
Os (1,3) -β-D-glicanos são compostos polissacarídeos que consistem em monômeros de glicose, particularmente os monômeros de D-glicose, ligados por ligações β-glicosídicas, que são produzidas por muitos organismos procarióticos e eucarióticos. Uma das principais fontes de contaminação por glicano em laboratórios vem da celulose de papel, pois esses compostos são encontrados nas paredes celulares das células das árvores. Como operações de filtragem são um processo comum na maioria dos laboratórios e são realizadas em muitas ocasiões usando papel de filtro de celulose, não é incomum descobrir que amostras sendo testadas para a presença de endotoxinas bacterianas contêm (1,3)-β-D-glicanos introduzidos pelas fibras desses mesmos filtros. Em muitos casos, um exame dos filtros não é concluído antes do teste, permitindo que os glicanos sejam lixiviados de certos tipos que acabam no filtrado. Frequentemente, esse problema só é detectado por meio de testes de rotina realizados no produto acabado usando o teste LAL. As amostras também podem ser contaminadas ao entrar em contato com outros organismos que produzem glicanos. Os glicanos contaminantes podem vir de diferentes fontes, como o zimosan de levedura, a laminarina de algas, lentinana de cogumelos shitake (frequentemente usados como um fármaco antitumoral) e curdlana que é produzido por bactérias.
Os β-glicanos também foram considerados patógenos em mamíferos e, portanto, uma preocupação séria de possível contaminação tanto no bioprocessamento quanto nos produtos sanguíneos. Quantidades elevadas de β-glicanos em produtos farmacêuticos finais podem iniciar uma resposta imune e, portanto, é necessário controlar seus níveis para evitar que quaisquer reações associadas ocorram no público em geral. Os β-D-glicanos, que têm vários efeitos em mamíferos, medeiam a resposta imune pela ativação de diferentes receptores envolvidos em reações pró-inflamatórias, como os encontrados em linfócitos, macrófagos e na cascata do complemento. Geralmente, eles não são digeridos no intestino. Eles são substâncias que servem como fonte de energia para diferentes micro-organismos que vivem no trato gastrointestinal por meio da fermentação. Essas moléculas têm sido utilizadas como método de diagnóstico de infecções fúngicas em humanos, como aditivo alimentar por suas propriedades como prebióticos e como imunomoduladores. Estudos foram conduzidos para seu uso como fármacos potenciais devido aos seus efeitos anticancerígenos e como redutores do colesterol por meio de sua capacidade de prevenir a absorção do colesterol dos alimentos no estômago e intestinos. Alguns dos β-glicanos mais amplamente estudados são paramylon de Euglena gracilis e a curdlana, originária de Alcaligenes faecalis, para a qual uma estrutura de hélice tripla foi sugerida.
Na prática, um pesquisador ou técnico frequentemente precisará saber a concentração de endotoxinas bacterianas sem a interferência de glicanos; mais notavelmente quando o teste LAL é usado como um método de detecção de pirogênios, uma vez que os glicanos em geral são substâncias que não causam febre.
Isso pode ser de particular importância nos processos associados ao tratamento de hemodiálise. Pacientes submetidos à hemodiálise convencional três vezes por semana são tipicamente expostos a 300–600 litros de água dependendo de sua prescrição (Coulliette, 2013), com água compreendendo mais de 90% do dialisado (Layman-Amato, 2013). Portanto, a presença de contaminação por bactérias gram-negativas ou endotoxinas associadas, seja na água de diálise ou no próprio dialisado, pode certamente ameaçar a vida e a saúde do paciente. A presença de microrganismos bacterianos nesses fluidos pode resultar em inflamação crônica, o que pode contribuir para o surgimento de doenças cardiovasculares, principal causa de morte em pacientes em diálise. Por outro lado, fragmentos de endotoxinas no banho de dialisado podem passar pelas membranas do dialisador e resultar em sintomas de septicemia, ou dar uma reação pirogênica (Coulliette, 2013). Uma vez que a fonte de água utilizada na hemodiálise consiste basicamente em água potável que foi transportada por vários níveis de purificação, ser capaz de monitorar com precisão sua qualidade é um aspecto vital do tratamento de hemodiálise.2
Ao considerar receptores de transplantes de órgãos ou células-tronco que são comumente tratados com fármacos imunossupressores, um nível significativo de morbidade e mortalidade foi mostrado por resultar de infecções fúngicas invasivas, onde a determinação dos níveis de β-D-glicanos mostrou ser uma ferramenta útil no diagnóstico presuntivo desses tipos de infecções.3
Ao tentar testar a presença de glicano, existem três métodos amplamente reconhecidos que são rotineiramente utilizados pela indústria hoje: método de hidrólise de base, método de subtração ou medição direta.
Ao utilizar a hidrólise básica, hidróxido de sódio é adicionado à amostra teste, que é então mantida a 37°C por 12-15 horas para destruir qualquer endotoxina que possa estar presente. Depois de ajustar o pH da mistura com HCL, a amostra pode então ser testada. Se o teste LAL subsequente der um resultado positivo, então isso indicaria que glicanos e não endotoxinas estão presentes.
Com o método de subtração, dois testes diferentes são utilizados para a determinação de endotoxina. Um teste irá incorporar um lisado que é inerentemente específico da endotoxina ou foi tratado com um bloqueador de glicano disponível comercialmente que tornará o reagente não reativo à interferência de (1,3) -β-D-glicano bloqueando efetivamente a via do Fator G da cascata de coagulação da endotoxina. O outro teste usa um produto lisado não tratado ou não modificado. A diferença entre os dois resultados é proporcional à quantidade de glicano presente na amostra.
O método de medição direta, como o nome indica, é uma determinação específica e quantitativa de (1,3) -β-D-glicanos por meio de métodos que inativam a endotoxina, como o uso de um detergente não iônico e polimixina B ou de um teste de anticorpo monoclonal especialmente projetado contra Fator C ativado.1
Independentemente do método de teste usado, a pesquisa em torno dos β-glicanos continua a ser de interesse para cientistas farmacêuticos em todo o mundo, tanto de uma perspectiva clínica quanto de manufatura. Ao contrário de endotoxinas bacterianas, os níveis de contaminantes de (1,3) -β-D- glicano em produtos farmacêuticos não são regulamentados e não há um padrão compendial para sua detecção. Além disso, não existe uma abordagem totalmente harmonizada disponível que permita
a determinação de níveis aceitáveis. No entanto, há uma tendência crescente na indústria e entre as autoridades regulatórias em todo o mundo para detectar e quantificar (1,3) -β-D- glicanos e compreender seus verdadeiros níveis de segurança.4
A importância dos β-glicanos como ferramentas na determinação de infecções fúngicas, como contaminantes problemáticos nos processos de fabricação farmacêutica e como possíveis ingredientes ativos em medicamentos atuais e futuros, colocou esses grupos diversos de polissacarídeos em uma categoria única que justifica uma investigação mais aprofundada. Para os testes de rotina no laboratório de controle de qualidade, continua a ser de vital importância estabelecer um método confiável e reprodutível de teste para que qualquer reação possa ser examinada para determinar se a causa é de fato devido à endotoxina ou à presença de de (1, 3) -β-D-glicano.1
REFERÊNCIAS
1. Sandle, T. PhD., “Pharmaceutical Product Impurities: Considering Beta Glucans”, American Pharmaceutical Review. 2013 Aug 31, online addition
2. “Dialysate Water System Microbiology & Endotoxin Sampling”, Provincial Standards and Guidelines, 2016 Aug; BCPRA Hemodialysis Committee
3. Theel, E.S. and Doern, C.D. “β-d-Glucan Testing Is Important for Diagnosis of Invasive Fungal Infections”, J Clin Microbiol. 2013 Nov; 51(11): 3478–3483.
Neun, B.W., Cedrone, E., Potter, T.M., Crist, R.M. and Dobrovolskaia, M.A., “Detection of Beta- Glucan Contamination in Nanotechnology- Based Formulations”, Molecules. 2020 Aug; 25(15): 3367, Published online 2020 Jul 24. doi: 10.3390/molecules25153367
Sobre o autor:
Lisa Komski, Gerente Geral de Vendas LAL
Lisa Komski é Gerente Geral de Vendas da Divisão LAL da FUJIFILM Wako Chemicals USA Corporation. Com quase 30 anos de carreira nas indústrias química e de ciências da vida, ela se estabeleceu como uma forte profissional de desenvolvimento de negócios, com grande foco no atendimento ao cliente. Quando criança, Lisa sonhava em se tornar médica. Portanto, ter a oportunidade de gerenciar a linha PYROSTAR(TM) nos últimos 6 anos permitiu que ela se envolvesse em um negócio dinâmico que apóia sua paixão ao longo da vida para ajudar a proteger a saúde e a segurança de outros. Lisa é formada em Biologia e Tecnologia Médica e também é fluente nos idiomas inglês e espanhol. Ao ter a oportunidade de passar um tempo pessoal, Lisa curte a família, amigos, viaja para o exterior e mima o seu adorável neto. Entre em contato comigo - Perfil do LinkedIn
