Seleção correta do método de teste e sensibilidade para detecção de endotoxinas

Riscos associados à exposição à endotoxina

Endotoxinas são pirogênios e componentes-chaves da membrana externa de bactérias gram-negativas. Se administrados por via parentérica, os produtos contaminados com endotoxinas podem levar a consequências graves, incluindo inflamação, hemorragia, choque séptico e até morte.¹ As endotoxinas estão ubiquamente presentes no ambiente, e os produtos farmacêuticos injetáveis e dispositivos médicos, bem como as matérias-primas de que são produzidos, devem ser testados quanto à contaminação por endotoxinas. Vários grupos de métodos para testes de endotoxinas foram desenvolvidos para atender a essa necessidade.²

Testes para detecção de endotoxina ou pirogênio

Teste de pirogênio de coelho

O teste de pirogênio de coelho foi historicamente um dos primeiros métodos desenvolvidos para detectar pirogênios.² É um teste in vivo baseado no fato de que a administração parenteral de pirogênios induz aumento de temperatura/febre em coelhos. No entanto, o teste de pirogênio de coelho não é específico para endotoxinas, porque um aumento de temperatura é provocado não apenas por endotoxinas, mas por todos os pirogênios. Além disso, o teste de pirogênio de coelho praticamente nunca é a escolha certa para uma nova aplicação de teste.

Teste de lisado de amebócito Limulus (LAL)

O teste LAL in vitro é o teste de endotoxina mais amplamente utilizado que substituiu comumente o teste de pirogênio de coelho.² O teste LAL é sensível e específico. Ele usa o reagente LAL isolado de amebócitos do caranguejo ferradura do Atlântico (Limulus polyphemus), que forma um coágulo quando incubado com uma endotoxina. O teste LAL pode ser realizado como um teste de gel-coágulo, cromogênico ou turbidimétrico.

Técnica de Gel-clot LAL

A técnica qualitativa de gel-clot LAL é o teste LAL padrão. Ele depende da interação de enzimas pró-coagulantes no LAL com endotoxinas, ativando uma cascata de coagulação, modificando o coagulogênio de amebócitos e formando um coágulo de gel. A formação de coágulos é então detectada visualmente. A técnica de gel-clot é sensível e fácil de usar, mas pode ser demorada, se um grande número de amostras precisar ser avaliado. No entanto, a técnica de coágulo em gel é frequentemente a opção mais adequada para novos programas de teste que exigem um teste fácil e versátil, fornecendo resultados consistentes.

Teste turbidimétrico LAL

O teste turbidimétrico LAL quantitativo baseia-se na formação de turbidez (nebulosidade) após a clivagem do substrato enzimático e antes da formação do gel. Níveis mais altos de endotoxina levam a um aumento mais rápido na turbidez, que podem ser quantificados usando um espectrofotométrico ou um leitor de microplaca. O teste turbidimétrico LAL também é sensível e confiável, mas permite a quantificação de dados e análise de alto rendimento. Além disso, é frequentemente o teste de escolha para novos usuários e usuários da técnica de gel-clot que está se expandindo para maiores volumes de teste e precisa de resultados quantitativos de endotoxinas.

Teste Cromogênico LAL

O teste cromogênico LAL representa uma modificação da reação de coágulo em gel. Baseia-se na clivagem de um substrato cromogênico, liberação de cromogênio e visualização de reação colorimétrica. O teste cromogênico LAL permite medições LAL altamente sensíveis, quantitativas e automatizadas e também pode ser ampliado para análise de alto rendimento. Muitas vezes, é a escolha certa para usuários que necessitam de testes além dos limites do teste turbidimétrico LAL. Isso pode ser porque a cor da amostra não é adequada para a transmissão transparente necessária para o teste turbidimétrico LAL, ou porque as amostras requerem testes com sensibilidade extremamente alta.

Outros métodos para detecção de endotoxinas e pirogênios

Teste de ativação de monócitos

O teste de ativação de monócitos (MAT) foi desenvolvido como um teste de pirogênio in vitro.² Ele depende do isolamento de monócitos do sangue humano periférico e sua incubação com uma amostra analisada quanto ao teor de pirogênio. Se a amostra estiver contaminada com pirogênios, ela estimula os monócitos a liberar citocinas inflamatórias, que podem ser quantificadas usando um teste de imunoabsorção enzimática (ELISA). O teste de ativação de monócitos é um ensaio in vitro confiável para detecção de pirogênio. No entanto, ele detecta todos os pirogênios e não apenas endotoxinas. No entanto, o teste de ativação de monócitos é frequentemente o teste de escolha para testes quantitativos de todos os pirogênios sem a necessidade de animais vivos.

Testes baseados em fator C recombinante

O fator C recombinante também foi usado para o desenvolvimento de testes de endotoxina. O fator C é o componente inicial da cascata de coagulação do caranguejo- ferradura, que é induzida por endotoxinas. Os testes baseados no fator C recombinante baseiam-se no princípio do teste LAL, mas evitam o uso de amebócitos de caranguejo-ferradura empregando o fator C recombinante.² . Eles são frequentemente a opção de teste mais adequada para novos usuários ou usuários do teste turbidimétrico LAL que estão animados para empregar um teste LAL inovador e completamente sintético que é livre de produtos de caranguejo-ferradura, mas mantém as vantagens do teste LAL tradicional.

Desenvolvimento de biossensores para detecção de endotoxinas

Biossensores, baseados emcomponentes de afinidade à endotoxina,estão sendo desenvolvidoscomo métodos de detecção de endotoxinas independentes da reação enzimática de LAL. No entanto, a padronização e ampla aplicação dessas novas abordagens ainda enfrentam desafios significativos.³

Considerações para a seleção do teste de endotoxina

O teste LAL substituiu em grande parte o teste de pirogênio de coelho como o teste padrão para detecção de endotoxinas. É confiável e sensível e pode ser conduzido como um teste de coagulação em gel, turbidimétrico ou cromogênico. No entanto, a seleção do teste mais adequado para a detecção de endotoxinas depende de vários fatores, incluindo o equipamento disponível, o número e as características das amostras que precisam ser avaliadas e, em certos casos, os requisitos regulamentares relevantes.²

Fontes de literatura:

1. Farhana A, Khan YS. Biochemistry, Lipopolysaccharide. [Atualizado em 29 de abril de 2021]. Em: StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2022 Jan-. Disponível em: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK554414/.
2. Suvarna, K. Endotoxin detection methods – Where are we now?American Pharmaceutical Review. 2015, August 25.
3. Su W, Ding X. Methods of endotoxin detection.Journal of Laboratory Automation. 2015 Aug;20(4):354–364.