As endotoxinas bacterianas, quando entram na corrente sanguínea humana, podem atuar como pirogênios poderosos que levam à febre, inflamação e, em casos graves, choque séptico. As bactérias Gram-negativas, que podem ser encontradas em todo o ambiente, contêm endotoxinas na sua membrana externa.
O ensaio LAL, que é o teste universalmente aceito para detectar endotoxinas, é aprovado por órgãos reguladores em todo o mundo e incluído na ‘Farmacopeia Internacional’.[1]Para cumprir a norma ANSI/AAMI ST108:2023, a Água Crítica usada para reprocessamento, esterilização e enxágue deve garantir que o nível de endotoxina permaneça abaixo de 10 UE/ml. Além disso, testes mensais são necessários para a conformidade com esta norma.[2]
Método de Gel-coágulo LAL
O teste de Gel-coágulo do Lisado de Amebócito Limulus (LAL) recebeu aprovação da Food and Drug Administration (FDA) durante a década de 1970 e desde então tem sido amplamente adotado como a técnica autorizada para detectar endotoxinas bacterianas.[3]
O método de gel-coágulo LAL, utilizando kits de teste único e multitestes PYROSTAR™ ES-F, representa a abordagem mais direta entre os métodos LAL, oferecendo sensibilidades que variam de aproximadamente 0,015 a 0,25 UE/mL.
O método de gel-coágulo é considerado o teste LAL mais sensível e preciso, com menos falsos positivos e menor vulnerabilidade à interferência em comparação com outros métodos.
É, no entanto, um processo demorado. Além disso, os resultados podem ser influenciados por fatores como desequilíbrio de pH, a presença de inibidores químicos como ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), a viscosidade da substância, agentes desnaturantes como um ácido ou base forte, um sal inorgânico concentrado ou um solvente orgânico e compostos alcoólicos básicos.[4]
Ensaios Cinéticos LAL: Método Cromogênico e Método Turbidimétrico
Os ensaios cinéticos podem ser conduzidos usando métodos cromogênicos e turbidimétricos, em que o desenvolvimento de cor ou turbidez é medido ao longo do tempo de incubação. Estes ensaios são de natureza quantitativa.
As técnicas são reconhecidas nas farmacopeias de vários países, como Europa, Estados Unidos, Japão e China, para a identificação da atividade de endotoxinas em água e produtos farmacêuticos.[5]
Ensaio Cromogênico
A série Limulus Color KY da FUJIFILM Wako inclui o kit de teste único Limulus Color KY para uso no sistema de medição Toxinometer® e o kit multiteste Limulus Color KY que pode ser utilizado no Toxinometer® ou em um leitor de microplacas.
Esses testes quantitativos, cinéticos e cromogênicos têm uma sensibilidade extremamente alta com um limite de detecção de faixa quantitativa de 0,0002 UE/mL para o formato de teste único e 0,0005 UE/mL para o formato de teste múltiplo. Eles também incluem reagentes específicos para endotoxinas e permitem a capacidade de realizar testes de LAL de alto rendimento ao utilizar a plataforma de microplaca.
O método cromogênico LAL automatizado economiza tempo, permite que mais testes sejam concluídos e é conhecido por sua natureza amigável e processo de cálculo simples. [4]
No entanto, os resultados podem diferir devido às diferenças significativas no coeficiente de variação (CV), que avalia a precisão dos testes. A sensibilidade do teste indica que a interferência pode causar problemas. Tal interferência pode surgir de substâncias que desnaturam proteínas, se ligam à endotoxina ou levam à precipitação.
Ocasionalmente, amostras como serina proteases podem mudar de cor após a reação com o LAL, o que pode interferir nos resultados do teste. [4]
Ensaio Turbidimétrico
O método turbidimétrico mede o tempo necessário para a mistura de reação atingir um nível predeterminado de absorbância ou transmissão ou a taxa de desenvolvimento de turbidez.[6]. É uma extensão automatizada do teste de gel-coágulo O reagente LAL modificado reduz o coagulogênio, levando a uma mistura turva que não coagula quando exposta à endotoxina.
A FUJIFILM Wako oferece três kits KTA: teste único PYROSTAR™ ES-F para o Toxinometer®, multiteste PYROSTAR™ ES-F para o Toxinometer® e PYROSTAR™ ES-F/Placa para o Leitor de Microplacas, todos específicos para endotoxinas.
Os kits de teste único e multiteste PYROSTAR™ ES-F, usados no sistema de medição Toxinometer®, aumentaram a sensibilidade com uma faixa de 0,001-10 UE/mL. O kit PYROSTAR™ ES-F/Placa, que permite o envolvimento em testes LAL de alto rendimento, tem uma faixa quantitativa de 0,01-10 UE /mL.
Ao utilizar o método turbidimétrico em vez do método de gel-coágulo mais simples, pode-se obter um resultado quantitativo, revelando o nível preciso de endotoxina na solução de amostra.
No entanto, a eficácia do método turbidimétrico no teste de sangue, plasma, soro e materiais semelhantes pode ser comprometida devido à sua maior vulnerabilidade a falsos positivos causados pela interferência de produtos suspensos ou turvos. [4]
Resumo
É crucial avaliar a adequação de cada Método de Detecção de Endotoxina do Ensaio LAL, pois cada método tem seus próprios pontos fortes e fracos. Técnicos que foram treinados nesses métodos podem minimizar o impacto da interferência e evitar resultados falsos.
Apesar das desvantagens associadas a essas abordagens, elas ganharam aceitação global e desempenham um papel vital na proteção do bem-estar do paciente.