Prós e contras de diferentes leituras de detecção de endotoxina

As endotoxinas bacterianas são pirogênios fortes que podem causar febre, inflamação e até choque séptico se tiverem acesso à corrente sanguínea humana. As endotoxinas, que são um componente integral da membrana externa das bactérias gram-negativas, são onipresentes no meio ambiente. Portanto, os dispositivos médicos e produtos farmacêuticos destinados ao uso parenteral devem ser rotineiramente submetidos a testes de endotoxinas. O teste de Lisado de Amebócito Limulus (LAL) é o teste padrão para a detecção de endotoxinas¹ , que foi aprovado por instituições regulatórias em todo o mundo e foi incluído na Farmacopeia dos EUA.

Métodos do teste de lisado de amebócito Limulus (LAL)

O teste LAL pode ser realizado usando três metodologias principais - gel-clot, turbidimétrico e cromogênico.^2,3 O método gel-clot é baseado na incubação de proteína extraída do lisado de sangue do caranguejo-ferradura com endotoxina, levando a uma reação de coagulação. Os métodos turbidimétrico e cromogênico são variações do método do gel-clot. O método turbidimétrico se baseia na formação de turbidez (nebulosidade) após a clivagem do substrato endógeno, enquanto o método cromogênico é baseado na produção de cromogênio após a clivagem de um substrato cromogênico.

Método de gel-clot LAL

O método de gel-clot LAL é qualitativo, sensível e fácil de usar. É o método LAL mais simples que se baseia na formação de um coágulo de gel e pode ser avaliado visualmente. O LAL é extraído de amebócitos primitivos no sangue do caranguejo-ferradura. O componente lipídico A da endotoxina interage com enzimas pró-coagulantes no LAL e ativa uma cascata de coagulação (incluindo fator B, fator C e uma enzima pró-coagulante), modificando o coagulogênio amebócito e levando à gelificação e formação de coágulo.

Os kits PYROSTAR™ ES-F teste único e multiteste contêm reagentes específicos de endotoxina (ES-F) de alta sensibilidade que não são ativados por (1→3)-β-D-glicano e, portanto, reduzem a taxa de resultados falso-positivos. Os mesmos kits usados para realizar o método de gel-clot também podem ser utilizados para realizar um teste cinético-turbidimétrico (KTA).

Teste cinético-turbidimétrico LAL

O teste turbidimétrico LAL é um teste quantitativo LAL, automatizado e altamente sensível, que também é baseado na reação gel-clot. Depende da formação de turbidez da solução de teste após a clivagem do substrato endógeno e antes da formação do gel. Um aumento mais rápido na turbidez indica níveis mais altos de endotoxina que podem ser quantificados usando um instrumento espectrofotométrico, como o Toxinometer®, ou um leitor de microplaca.

A FUJIFILM Wako oferece três kits KTA: teste único PYROSTAR™ ES-F para o Toxinometer®, multiteste PYROSTAR™ ES-F para o Toxinometer® e ES-F/Placa PYROSTAR™para o Leitor de Microplaca, todos os quais são específicos para endotoxinas. Os kits de teste único e multitestes PYROSTAR™ ES-F, usados no sistema de medição Toxinometer® , aumentaram a sensibilidade com uma faixa de 0,001–10 UE/mL. O kit ES-F/Placa PYROSTAR™, que permite a participação em testes de LAL de alto rendimento, tem uma faixa quantitativa de 0,01–10 UE/mL.

Teste cromogênico LAL

O teste cromogênico LAL também é uma modificação da reação gel-clot e permite medições LAL altamente sensíveis e automatizadas. O teste cromogênico LAL depende da adição de um substrato cromogênico específico, que simula o local de clivagem no coagulogênio, ao LAL. A reação de coagulação causa a hidrólise do substrato cromogênico, liberando o cromogênio amarelo p-nitroanilina (pNA) e permitindo a visualização da reação.

A série Limulus Color KY da FUJIFILM Wako inclui o kit Limulus Color KY teste único para uso no sistema de medição Toxinometer® e o kit Limulus Color KY Multiteste que pode ser utilizado no Toxinometer® ou em um leitor de microplaca. Esses testes quantitativos, cinéticos e cromogênicos têm uma sensibilidade extremamente alta com um limite de detecção de faixa quantitativa de 0,0002 UE/mL para o formato de teste único e 0,0005 UE/mL para o formato de teste múltiplo. Eles também incluem reagentes específicos para endotoxinas e permitem a capacidade de realizar testes de LAL de alto rendimento ao utilizar a plataforma de microplaca.

Quais são os prós e os contras das diferentes leituras de detecção de endotoxinas?

O teste LAL pode ser realizado usando três metodologias principais: gel-clot, turbidimétrico e cromogênico. Todos os três métodos são amplamente aceitos e encontraram amplas aplicações na prática (Tabela). O método de gel-clot LAL é o mais simples; no entanto, ainda é muito sensível e confiável. Os testes turbidimétricos e cromogênicos permitem a quantificação de endotoxinas e uma avaliação de alto rendimento. No entanto, exigem o uso de automação adicional, enquanto o método do gel-clot não. O teste cromogênico FUJIFILM Wako tem o limite de detecção mais baixo entre as três metodologias, o que o torna especialmente útil para casos com concentrações de endotoxina extremamente baixas. Os kits de gel-clot e turbidimétricos PYROSTAR™ incluem a mesma linha de reagentes específicos para endotoxinas e podem ser usados durante diferentes estágios de desenvolvimento de produtos farmacêuticos ou dispositivos médicos.

Assim, embora todos os métodos de teste LAL sejam sensíveis, confiáveis e fáceis de usar, a seleção de um teste individual deve ser baseada nas necessidades dos pesquisadores e adaptada às especificações dos produtos testados.

Referências

1. Mehmood Y. What is Limulus amebocyte lysate (LAL) and its applicability in endotoxin quantification of pharma products. Em: Cultivo e Manuseio de Culturas Bacterianas. 8 de janeiro de 2019. InTechOpen.
2. Joiner TJ, Kraus PF, Kupiec TC. Comparison of endotoxin testing methods for pharmaceutical products. International Journal of Pharmaceutical Compounding. 2002;6:408–409.
3. Wheeler A. Comparing endotoxin detection methods. Pharmaceutical Technology. 2017;41(11):58–62.

Tabela. Características dos testes FUJIFLM Wako para detecção de endotoxinas