Reagentes e Acessórios para o Teste do Lisado de Amebócito de Limulus (LAL)

O Teste ou Ensaio do Lisado de Amebócito de Limulus (LAL) é um método para a detecção e quantificação de endotoxinas bacterianas amplamente utilizado pela indústria farmacêutica e biotecnológica. O seu princípio bioquímico é baseado na reação de coagulação da hemolinfa de Limulus polyphemus ou Caranguejo-Ferradura do Atlântico, como é conhecido popularmente, na presença de antígenos de superfície microbiana, como os Lipopolissacarídeos ou endotoxinas bacterianas.

A empresa Wako Chemicals destaca-se entre as empresas fabricantes de reagentes LAL a nível internacional por sua formulação única de reagente LAL específico para a endotoxina bacteriana, sem a interferência de beta-glicanos nas amostras, graças à adição de Curdlano carboximetilado (CMC) co-liofilizado com o LAL. Sob a marca Pyrostar™, esta empresa distribuidora de reagentes para a pesquisa, fabrica e comercializa reagentes e acessórios LAL que estejam em conformidade com todas as normas, regulamentações e padrões de qualidade estabelecidos pelo FDA dos Estados Unidos.

A seguir, vamos comentar sobre os diversos reagentes e acessórios com os quais a Wako contribui para o estudo das endotoxinas bacterianas:

Em primeiro lugar, temos o kit de Teste Único de Limulus PS, com o qual pode-se detectar e quantificar endotoxinas sem a interferência de outras substâncias coexistentes, usando um adsorvente de afinidade para a endotoxina chamado de Pyrosep™. Com este método, pode ser medida a endotoxina em uma amostra lipofílica, desde que ela possa ser dissolvida em etanol, por exemplo, em vitaminas lipossolúveis, óleos e gorduras, albuminas, entre outras, que geralmente não podem ser medidas com um teste de Limulus convencional. Além disso, nenhum reagente LAL é desperdiçado, uma vez que é fornecido individualmente em frascos de teste único e pode ser utilizado na quantidade exata necessária para a medição.

A série PYROSTAR™ ES-F é uma formulação única que contém Curdlan carboximetilado (CMC) co-liofilizado com o LAL, com o objetivo de eliminar a interferência com β-glicanos. O tampão ES desenvolvido pela Wako contém altas concentrações de CMC, convertendo o reagente LAL especificamente para a endotoxina. Este reagente foi projetado para ser utilizado tanto para a detecção qualitativa das endotoxinas através da coagulação em gel (gel-clot), como para a sua quantificação através de métodos cinéticos turbidimétricos (KTA). É utilizado um instrumento fotométrico, como o Toxinometer®, desenvolvido pela Wako Pure Chemical Industries, Ltd., para medir a velocidade de variação da turbidez. Os kits PYROSTAR™ ES-F estão disponíveis com e sem Controle Padrão de Endotoxina (CPE): um reagente liofilizado contendo endotoxina refinada partir de E. coli e é utilizado para confirmar a sensibilidade do reagente LAL, validar os métodos de ensaio do produto e preparar controles de inibição.

Como apoio para estes reagentes, a Wako também desenvolve uma Solução Extratora de Endotoxina capaz de extrair endotoxinas de superfícies de onde não podem ser extraídas com água ou sal. É recomendado o seu uso nos testes de endotoxinas sobre equipamentos e dispositivos que poderiam estar em contato com sangue ou fluidos contendo sangue ou proteínas.

O Toxinometer® ET-6000 é um leitor cinético de incubação computadorizado que pode incorporar os três métodos de ensaio: gel-clot, KTA e KCA (ensaio cinético cromogênico). O aparelho permite a obtenção dos resultados de gel-clot e KTA da mesma amostra. Mede simultaneamente até 16 amostras com um risco de contaminação muito menor que a microplaca e permite o arquivamento das curvas padrão. Toximaster® QC7 é um software que fornece todas as funções para o processamento de dados e elaboração dos relatórios para o teste LAL através do Toxinometer® ET-6000.

Além disso, entre os acessórios do catálogo LAL de Wako, estão os tubos de ensaio com e sem tampas de alumínio. Eles são fabricados de vidro borosilicato livre de endotoxinas  e projetados para o método gel-clot. A espessura do vidro está calibrada especificamente para o Toxinometer para uma intensidade de luz e transmitância estáveis.

Outro dos reagentes LAL que a Wako comercializa é o kit Limulus Color KY. Este reagente é projetado para o método KCA e pode ser utilizado tanto no leitor cinético como em um leitor de microplacas. Inclui um kit de teste múltiplo e um kit de teste simples, cada um projetado para uma análise colorimétrica em função do tempo, usando um substrato sintético que gera uma cor amarela e pode detectar especificamente a endotoxina com alta sensibilidade.

Bibliografia:

1) Iwanaga, S. Biochemical principle of Limulus test for detecting bacterial endotoxins. Proceedings of the Japan Academy, Series B, 83(4), 110-119. (2007).

2) Guideline on Validation of the Limulus Amebocyte Lysate Test as an End-Product Endotoxin Test of Human and Animal Parenteral Drugs, Biological Products and Medical Devices. U.S. Dept. of Health & Human Services, FDA, December (1987).

3) Katsuhito Inoue, Aya Takaoka, Masakazu Tsuchiya, Shuji Matsuura: Excerpt 110 (1992), 6th Annual Meeting of the Japanese Society for Alternatives to Animal Experiments.

4) Katsuhito Inoue, Tomoaki Harada, Masakazu Tsuchiya, Shuji Matsuura: Excerpt 44 (1994), 21st Annual Meeting of the Society for Antibacterial and Antifungal Agents.

5) Tsuchiya, M.; Oishi, H.; Takaoka, A.; Fusamoto, M. y Matsuura, S. Discrimination between endotoxin and (1–3) beta-D-glucan using turbidimetric kinetic assay with Limulus amebocyte lysate. Chem Pahrm Bull (Tokyo), 38(9). 2523. (1990).

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