Produtos de Terapia Gênica e LAL
A terapia gênica está revolucionando a maneira como tratamos doenças humanas. Qualquer técnica que modifique os genes de uma pessoa para tratar ou curar uma doença é considerada uma forma de terapia gênica. Isso pode ocorrer por meio de vários mecanismos possíveis. Uma versão causadora de doenças de um gene pode ser desativada ou substituída por uma versão saudável. Alternativamente, um novo gene pode ser introduzido para combater uma doença.
Uma grande variedade de vetores está disponível para terapia gênica. Os dois mais comuns são plasmídeos e vírus. Os plasmídeos são sequências circulares de DNA que podem ser expressas transitoriamente nas células. Por outro lado, os genes empacotados pelos vetores virais podem ser integrados aos genomas das células hospedeiras e expressos de forma permanente.
Como todas as terapêuticas humanas, é fundamental que os produtos da terapia gênica estejam livres de contaminação por endotoxinas. A endotoxina, também conhecida como lipopolissacarídeo ou LPS, é um componente da membrana celular externa das bactérias Gram-negativas. É um pirogênio extremamente potente, com uma exposição minúscula que pode causar febre perigosa ou até sepse. Além disso, a endotoxina é altamente resistente ao calor e, portanto, difícil de remover pelos meios tradicionais.
De acordo com as diretrizes do FDA, todos os produtos farmacêuticos injetados por via intravenosa devem conter menos de 5 unidades de endotoxina por kg de peso corporal. A endotoxina é altamente onipresente, e os ambientes de laboratório não são exceção, portanto, é crucial que os produtos de terapia gênica sejam testados para contaminação por endotoxina antes de serem usados em seres humanos.
O teste de lisado de amebócito Limulus (LAL) oferece um método custo-efetivo e altamente sensível para quantificar os níveis de endotoxina. O teste se baseia em proteínas extraídas do sangue de caranguejos-ferradura. Essas proteínas sofrem uma reação de coagulação na presença de endotoxina, que pode ser quantificada para fornecer uma leitura altamente precisa dos níveis de endotoxina.
Um artigo de 2019 publicado em Molecular Therapy — Methods & Clinical Development testou um novo método para remover a contaminação por endotoxina de estoques de vírus adenoassociados recombinantes (rAAV), um vetor comum para terapia gênica. O rAAV é preparado usando DNA de plasmídeo isolado de bactérias E. coli, que é frequentemente uma fonte de contaminação por endotoxinas.
Os autores usaram o teste LAL para quantificar os níveis de endotoxina. Um dos desafios com a descontaminação de estoques de rAAV é que quaisquer detergentes residuais podem não apenas induzir toxicidade, mas também interferir com os reagentes do teste LAL, levando a falsos negativos. Isso se deve ao efeito de mascaramento, em que uma molécula de LPS fica cercada por moléculas de detergente e, portanto, protegida da interação com os reagentes LAL. No entanto, os autores foram capazes de manter os níveis de detergente abaixo dos níveis críticos em seus estoques descontaminados, permitindo leituras precisas de endotoxinas usando LAL.
Este estudo destaca a importância da descontaminação completa dos produtos da terapia gênica, bem como a necessidade de lavagem rigorosa com troca de tampão a fim de remover o detergente residual. À medida que a popularidade da terapia gênica aumenta, continuará sendo crucial que os cientistas estejam cientes dos perigos potenciais da contaminação por endotoxinas e da necessidade de evitar falsos negativos causados pelo carreamento por detergente.
