Procedimentos de pipetagem e dicas para executar um ensaio preciso

Publicado em 15th November 2022

Mesmo pequenas variações nos procedimentos de pipetagem podem afetar seriamente os resultados do ensaio. Isto é particularmente significativo se os resultados puderem ser relevantes para decisões clínicas ou de fabricação, como no caso do ensaio de lisado de amebócitos Limulus (LAL) usado para avaliar amostras quanto à contaminação por endotoxinas. No entanto, imprecisões foram detectadas em uma proporção substancial de indivíduos que realizam pipetagem manual e, especialmente, ao pipetar pequenos volumes. Em um estudo, a imprecisão média de pipetagem intraindividual foi de 5,7%, 0,8% e 0,2% para pipetagem de 10 μL, 100 μL e 1 mL, respectivamente. Além disso, a imprecisão interindividual média foi de 8,1%, 1,1% e 0,4% para pipetagem de 10 μL, 100 μL e 1 mL, respectivamente.1 

Características de uma técnica de pipetagem adequada

Todas as etapas do procedimento de pipetagem, incluindo preparação, absorção de líquido (aspiração) e descarga de líquido devem ser consideradas para garantir o uso de uma técnica adequada.2 O manuseio excessivo da pipeta e da ponteira deve ser minimizado para evitar contaminação. Recomenda-se pré-umidecer a ponteira da pipeta pipetando o volume selecionado para cima e para baixo. Para a absorção do líquido, a ponteira da pipeta deve ser imersa alguns milímetros abaixo da superfície do líquido, e o líquido deve ser aspirado lenta e uniformemente. Após a aspiração, o experimentador deve fazer uma pausa por 1–3 s para deixar o líquido subir na ponteira. A velocidade consistente e a pressão do êmbolo devem ser aplicadas durante toda a descarga de líquido. Finalmente, a ponteira deve ser examinada antes e depois de cada descarga de líquido para garantir que o volume total tenha sido dispensado.

 

Além das características descritas de uma técnica de pipetagem adequada, a adesão às seguintes dicas ajudaria na entrega de resultados consistentes e confiáveis:

  1. Selecione uma técnica de pipetagem adequada para cada solução – A pipetagem em modo padrão (direto) é usada para soluções aquosas, que são a maioria das soluções usadas em experimentos de laboratório. A pipetagem em modo reverso é recomendada para líquidos com alta viscosidade ou volatilidade.
  2. Selecione uma pipeta com uma faixa de volume ótima – A utilização de uma pipeta com uma faixa de volume ótima para os experimentos planejados reduz o risco de erros relacionados ao usuário. Para as pipetas de deslocamento de ar comumente empregadas, essa faixa é de 35% a 100% do valor nominal.
  3. Manuseie e mantenha as pipetas com cuidado – As pipetas devem ser verificadas quanto à contaminação diariamente. Quando não estiverem em uso, elas devem ser armazenados em um suporte de pipeta designado para evitar danos e devem ser mantidas longe de reagentes potencialmente prejudiciais.
  4. Realize calibração regular – As pipetas devem ser calibradas em intervalos regulares para manter sua precisão e exatidão dentro da faixa recomendada (comumente ± 5% das especificações).3 A calibração deve ser realizada em condições que se assemelhem tanto quanto possível às condições experimentais reais. O intervalo de calibração recomendado depende da aplicação e da frequência do uso da pipeta.
  5. Garanta o treinamento da técnica de pipetagem do pessoal do laboratório – Ensinar aos experimentadores uma técnica adequada de pipetagem é um pré-requisito para obter resultados experimentais confiáveis. Esta noção é apoiada pelas descobertas de um estudo realizado com o pessoal de um laboratório forense, que mostrou que o treinamento da técnica de pipetagem melhorou a precisão da pipetagem.4
  6. Se possível, trabalhe em um equilíbrio de temperatura – Se as condições e requisitos experimentais permitirem, manter a pipeta, as ponteiras e a solução em temperaturas ambientes pode influenciar positivamente a precisão dos resultados.
  7. Descarte a primeira e última dispensa – Quando múltiplas alíquotas são dispensadas, recomenda-se descartar a primeira e última alíquota.
  8. Projete um plano experimental completo e eficiente – Um plano experimental eficiente ajudaria a evitar erros relacionados ao usuário, especialmente ao pipetar longas séries de alíquotas em microplacas. Aplicativos web que facilitam o planejamento experimental, como Pipette Show, estão sendo desenvolvidos.5

 

Fontes de literatura

  1. Lippi G, Lima-Oliveira G, Brocco G, Bassi A, Salvagno GL. Estimating the intra- and inter-individual imprecision of manual pipetting. Clin Chem Lab Med. 2017;55(7):962-966. doi: 10.1515/cclm-2016-0810.
  2. Ewald K. Impact of pipetting techniques on precision and accuracy. Guia do usuário Eppendorf. No 20, Maio de 2015. Disponível online em: https://www.eppendorf.com/uploads/media/USERGUIDE_20_GB_Final_25.pdf.
  3. Sanders ER. Aseptic laboratory techniques: volume transfers with serological pipettes and micropipettors. J Vis Exp. 2012;(63):2754. doi: 10.3791/2754.
  4. Epstein DM, Tebbett IR, Boyd SE. Eliminating sources of pipetting error in the forensic laboratory. Forensic Science Communications. 2003;5(4).
  5. Falk J, Mendler M, Kabisch J. Pipette Show: An open source web application to support pipetting into microplates. ACS Synth Biol. 2022;11(2):996-999. doi: 10.1021/acssynbio.1c00494.