Perigos da interferência do teste de endotoxina em injetáveis parenterais fabricados por AAV personalizados
O risco de contaminação por endotoxinas de vetores de vírus adenoassociados (AAV)
A terapia gênica implementa técnicas genéticas para distribuir uma cópia gênica funcional ou para restaurar a função fisiológica de um gene e tem grande potencial para o tratamento de várias doenças. Os vetores de vírus adenoassociados (AAV)são derivados de parvovírus não patogênicos, com defeito de replicação e sem envelope e podem servir como uma ferramenta eficiente de distribuição de genes. As primeiras terapias genéticas baseadas em AAV obtiveram aprovações regulatórias nos Estados Unidos e na Europa.
Como outros produtos farmacêuticos ou biológicos, os terapêuticos baseados em AAV correm o risco de contaminação por endotoxinas. As endotoxinas são pirogênios poderosos, que podem provocar febre, inflamação e choque séptico, se tiverem acesso aos sistemas cardiovascular ou linfático, líquido cefalorraquidiano ou ambiente intraocular. Estão presentes na membrana externa de bactérias gram-negativas e são liberadas no ambiente principalmente durante a lise celular bacteriana. Como as terapias baseadas em AAV são geralmente administradas como injetáveis parenterais, elas devem ser submetidas a testes rigorosos de endotoxinas.
Princípios do teste de endotoxinas
O ensaio de lisado de amebócitos Limulus (LAL) tem sido amplamente aceito como padrão ouro para testes de endotoxinas devido à sua alta sensibilidade e especificidade. Consequentemente, foi adotado pelas farmacopeias dos Estados Unidos, da União Europeia e do Japão. O teste LAL pode ser realizado como um ensaio qualitativo de gel-coágulo ou ensaios quantitativos cromogênicos ou turbidimétricos. Além disso, ensaios LAL sintéticos estão sendo desenvolvidos para eliminar a necessidade de sangramento de caranguejo-ferradura para a produção de reagente LAL.
Desafios do teste de endotoxinas de vetores AAV
O teste de endotoxina de vetores AAV está associado a desafios. Por exemplo, a fabricação de AAV é propensa à contaminação por endotoxina e os injetáveis parenterais à base de AAV requerem testes rigorosos de endotoxina. Além disso, como os produtos baseados em vetores AAV são normalmente fabricados em pequena escala, os cronogramas de testes padrão podem nem sempre ser viáveis. Ademais, os produtos derivados durante o processo de fabricação do AAV podem interferir no teste LAL.
O valor de cronogramas alternativos para testes de endotoxinas de vetores AAV
Depois de garantir a consistência do processo de fabricação, cronogramas alternativos de testes de endotoxinas devem ser considerados por empresas de produção personalizada que fabricam vetores de VAA e outros produtos de terapia genética em pequena escala. O Instituto Nacional Americano de Padrões (ANSI)/Associação para o Avanço da Instrumentação Médica (AAMI) estabeleceram diretrizespara a concepção de planos alternativos de testes de endotoxinas durante a fabricação e em produtos finais. Notavelmente, os planos de testes alternativos devem estar alinhados com os requisitos regulamentares, devem considerar as principais etapas de fabricação e devem incluir um plano de amostragem bem elaborado.
Desenvolvimento de protocolos para descontaminação de amostras de AAV
Estratégias de Boas Práticas de Fabricação (GMP) foram desenvolvidas para a produção de vetores AAV. Além disso, protocolos estão sendo projetados para a descontaminaçãode amostras concentradas de AAV. Ao descontaminar os estoques de LAL, é importante manter o nível de detergentes abaixo de um limite crítico, porque os detergentes residuais podem ter um efeito de mascaramento, causando uma interferência com os reagentes LAL.
O potencial de cepas de baixa endotoxina de E. coli
Além disso, cepas de baixa endotoxina de E. coliforam propostas para isolamento de DNA plasmidial como uma estratégia para diminuir o nível de endotoxinas em amostras de AAV. Esta abordagem é supostamente escalonável e pode ser usada tanto em laboratórios acadêmicos quanto para desenvolvimento clínico.