Deteção de endotoxinas mediante o ensaio de LAL, Método Turbidimétrico

No artigo anterior deste blog fez-se referência ao método Gel-Clot para quantificar endotoxinas usando o ensaio do lisado de amebócitos de Limulus (LAL). O presente trabalho pretende abordar o método turbidimétrico que é outra técnica utilizada para a análise de endotoxinas.

Como já se referiu o lisado de amebócitos de Limulus é útil para a deteção de endotoxinas tanto em matérias-primas como nos produtos finais das indústrias farmacêutica, alimentar e outras, sendo também empregue com fins de investigação. Este ensaio pode ser utilizado de maneira qualitativa, semiquantitativa ou mesmo quantitativa, segundo necessário. A análise qualitativa pelo método de Gel-Clot é mais simples e barata pois não necessita nenhum equipamento para detetar a formação do gel que indica a presença de endotoxinas e, como tal, o resultado positivo do teste de LAL. Outros métodos mais caros, contudo, também, por vezes mais precisos são os colorimétricos e turbidimétricos, sendo o método cinético turbidimétrico quiçá o mais utilizado já que requer o uso de equipamento igual ao colorimétrico, apesar de não ser necessária a adição de nenhum reagente capaz de apresentar uma cor específica.

A turbidimetria: técnica analítica ao serviço das investigações em biomedicina, microbiologia e biotecnologia

A turbidimetria é uma técnica analítica ótica que se baseia no fenómeno que ocorre quando aparecem partículas sólidas numa solução homogénea. Esta perda de homogeneidade faz com que uma luz que atravesse a solução não seja de igual intensidade a uma que a atravesse antes do estado de turbidez. Entende-se por turbidez “a propriedade ótica de uma amostra que faz com que a radiação disperse e seja absorvida mais do que transmitida em linha reta através da amostra”. Se a luz transmitida é medida num comprimento de onda particular, pode-se obter um valor que é proporcional à concentração da substância, ou substâncias presentes na solução responsáveis pela turbidez. Para estas medições utiliza-se um espectrofotómetro, que é um equipamento bastante comum em laboratórios analíticos e clínicos. Desenvolveram-se também aparelhos específicos para esta técnica, designados turbidímetros, no entanto, não são mais do que variantes de um espectrofotómetro.

Os métodos turbidimétricos são muito utilizados em biologia, em primeiro lugar para controlar o crescimento celular e a contagem de células em solução e também para outras técnicas analíticas relacionadas com a deteção de microrganismos como é o ensaio de LAL. Para controlar o crescimento de uma cultura de células, que podem por exemplo ser bactérias, por turbidimetria, há que ter em conta que para a dispersão da luz é relevante não só o número de células, como também o seu tamanho. A turbidimetria permite avaliar o crescimento estimando a massa celular contida numa amostra. Para evitar erros nas medições turbidimétricas resolveu-se medir curvas standard para cada microrganismo. Usando a turbidimetria podem-se obter retas que relacionam a transmitância com o peso seco dos microrganismos quando estes se encontram em soluções diluídas, cumprindo-se os princípios da Lei de Lambert Beer.

Teste de lisado de amebócitos de Limulus usando o método turbidimétrico

O princípio do teste de LAL é a reação de coagulação que ocorre quando os amebócitos extraídos do caranguejo Limulus Polyphemus entram em contacto com endotoxinas bacterianas. As endotoxinas provocam que se desencadeie uma série de reações em cascata que finalizam com a precipitação de proteínas sob a forma de gel. A importância de realizar este teste em todos os produtos farmacêuticos, alimentares ou de outro qualquer tipo que vão entrar em contacto com humanos assenta no dano que as bactérias Gram negativas podem causar ao organismo. Estas bactérias são as que libertam as endotoxinas quando são atacadas pelos mecanismos de defesa dos humanos e se rompe a sua membrana celular. A libertação de endotoxinas provoca uma resposta imune que tem como resultado a libertação de citoquinas. Altos níveis de citoquinas no sangue podem causar afeções respiratórias severas, processos associados à morte de uma grande quantidade de células e, inclusivamente, a morte.

VER TAMBÉM: O impacto das endotoxinas sobre o corpo humano

Quando se deseja aplicar a turbidimetria nos ensaios de LAL, o que medimos é a turbidez da solução com o início da formação da coagulina, proteína insolúvel responsável pelo aparecimento de um gel no tubo em que realiza o ensaio. Com os padrões da endotoxina, podemos medir a turbidez por um método espectrofotométrico e esta medida permite-nos quantificar a quantidade de endotoxinas presentes, pelo que os resultados de este ensaio são sempre relativos. A análise pode ser conduzida através do método turbidimétrico do ponto final ou do método turbidimétrico cinético.

No ensaio por turbidimetria do ponto final há que realizar a leitura da turbidez num tempo específico. Isto gera erros de manipulação e tem a desvantagem de que, se a leitura não for realizada corretamente numa amostra, torna-se necessário repetir todo o processo, ou seja, que há um único momento para realizar a medição e que deve ser preciso. Ao não ser lida a turbidez no momento indicado, a gelificação continua. Por todas estas razões este método não é muito utilizado.

Sem dúvida de que o método turbidimétrico cinético teve mais êxito, em parte pelos avanços tecnológicos que nas últimas décadas possibilitaram acoplar leitores de placas multimedidas, com controlo de temperatura e todo o processo de recolha de dados que passou a ser totalmente informatizado. Outra das características deste método que o torna muito popular na hora de desenvolver um ensaio de LAL é o seu baixo limite de deteção e o amplo espectro de concentrações de endotoxinas em se podem realizar as medidas: podem-se construir curvas padrão num espectro de concentrações de até 100 unidades de endotoxinas por mililitro de solução.

A relação entre o tempo de formação da turbidez no ensaio de LAL e a concentração de endotoxina é exponencial. Assim, utilizando os antilogaritmos da variável tempo e os antilogaritmos da concentração das soluções padrão pode-se obter uma linha reta. Mediante a reta obtida por regressão, pode-se conhecer, em experiências posteriores, as concentrações de endotoxina nas amostras que são objeto de estudo. O fator temperatura tem um papel fundamental nestes ensaios, para obter uma boa reprodutibilidade e exatidão de resultados há que assegurar o controlo da temperatura. É necessário trabalhar à temperatura indicada em cada protocolo.

Investigaram-se diferentes variantes do ensaio de LAL usando a turbidimetria, que culminaram numa série de testes rápidos de deteção de endotoxinas realizando o ensaio a temperaturas superiores às usuais e que rondam os 37ºC, ou por exemplo, a introdução de reagentes em nanopartículas.

O teste Limulus ES-2 e o PYROSTAR™ ES-F/Plate são produtos que a Wako comercializa e que servem para a deteção de endotoxinas bacterianas aplicando o método cinético da turbidimetria. Estes produtos são vendidos com o intuito de serem utilizados em medições realizadas com fins investigativos, em nenhum caso devem ser utilizados como métodos de diagnóstico.

Para utilizar o reagente PYROSTAR™ ES-F/Plate é necessário contar com um leitor de microplacas como o Tecan Sunrise™ Microplate Reader e o software correspondente. O procedimento a seguir consiste numa série de medições para se obter uma curva de calibração que cubra entre 10 unidades a menos e 10 unidades a mais do que as que se presumem encontrar na amostra. Realizam-se medidas em controlos positivos e negativos e as amostras medem-se em duplicado, para assegurar a qualidade das medições. Devem-se anotar medidas a cada 40 segundos, a 405 nm e a uma temperatura de 37ºC de cada um dos poços da microplacas uma vez adicionado o reagente PYROSTAR™ ES-F/Plate às amostras. O leitor de microplacas monitoriza a turbidez das amostras para determinar o tempo que demora a que esta surja e, com os dados da transmitância, o software calcula a curva de regressão que permite determinar a concentração de endotoxinas. Este reagente inclui o Curdlan (β-1,3-glucano) para eliminar a interferência que este composto produz e pode ser vendido juntamente com endotoxina standard de controlo ou sem esta substância.

Wako também fabrica um instrumento fotométrico que pode ser utilizado para medir a velocidade da troca na turbidez da solução no ensaio de LAL, chamado Toxinometer Série ET-6000. Este equipamento utiliza um LED de 430 nm como fonte de luz e, entre outras vantagens, tem a de controlar a temperatura, algo bastante importante neste teste.

ACESSÓRIOS LAL

Frasco de Água Reagente para LAL	Tubos para Reações de Gelificação	Controle Padrão de Endotoxina (CPE)