Métodos analíticos para a detecção de endotoxinas bacterianas

Existem três métodos analíticos para a determinação de endotoxinas bacterianas através do teste de lisado de amebócitos de Limulus, conhecido pela sua sigla como teste LAL. Estes métodos são o Gel-Clot, o turbidimétrico e o colorimétrico, que podem ser realizados de maneira qualitativa ou quantitativa.

Método Gel-Clot

O método Gel-Clot ou de coagulação mede a quantidade de gel formada como consequência da reação que ocorre no lisado de amebócitos na presença de endotoxinas. Na hemolinfa do caranguejo Limulus Polyphemus, uma série de reações em cadeia acontecem em resposta às endotoxinas, que terminam na coagulação da proteína coagulina, sendo esta reação facilmente observável pela formação do gel no tubo de ensaio. Para considerar que o teste LAL deu um resultado positivo através do método Gel Clot, o tubo onde a reação ocorreu é invertido e verifica-se que o gel formado se mantém separado da mistura após esse processo. Esta maneira de usar o método Gel Clot seria qualitativa e é muito útil para testes rápidos, in situ, onde é necessário saber se uma amostra está contaminada ou não por bactérias Gram-negativas. Existe também a possibilidade de aplicar este método semiquantitativamente. Medindo a quantidade de gel formada no tubo de reação, a quantidade de endotoxinas contidas na amostra pode ser calculada.

Método Turbidimétrico

Como mencionado anteriormente, a reação provocada pelas endotoxinas bacterianas na hemolinfa do caranguejo produz o aparecimento de proteínas sólidas, portanto, gera turbidez da amostra. Este fato é usado para detectar a presença de endotoxinas por turbidimetria, uma técnica espectrofotométrica com a qual os dados de medição podem ser obtidos por meio do método do ponto final ou do método cinético. O método cinético turbidimétrico é o mais utilizado na indústria para o controle de qualidade de matérias-primas e produtos finais, sendo o método de controle de pirogênios recomendado atualmente pelas organizações internacionais. Este método pode ser usado em uma grande variedade de matrizes e tem a vantagem de que a cinética da reação possa ser medida, por isso é mais preciso do que o método Gel Clot. Usando os acessórios e reagentes vendidos pela marca PYROSTAR™, várias amostras podem ser medidas simultaneamente. O Toxinometer® ET - 6000 Series permite a leitura em placas multipoços em uma ampla gama de concentrações de endotoxina e o controle da temperatura em que o teste é realizado.

Método Cromogênico

O método cromogênico aplicado ao teste do lisado de amebócitos de Limulus (LAL) consiste em adicionar um reagente desenvolvedor de cor que permite realizar a quantificação de endotoxinas medindo a absorbância da amostra. O reagente cromóforo utilizado nos testes colorimétricos LAL é a p-nitroanilina, que inicialmente se encontra em uma forma incolor, sendo ligada a um peptídeo. Produto das reações das endotoxinas com o lisado de amebócitos, é liberada a p-nitroanilina de maneira proporcional à quantidade de endotoxinas que estão na mistura. Esses processos são explorados para usar os dados de absorbância, construindo uma curva de calibração, para o cálculo da concentração de endotoxinas. Tal como no método turbidimétrico, as análises podem ser realizadas pelo método do ponto final ou pelo método cinético, onde os dados de absorbância da amostra são levados em consideração após diferentes tempos após a adição do lisado. Como em qualquer método cromogênico, deve-se ter em conta que a amostra em estudo não apresenta interferência na zona de medição, qualquer molécula que absorva em comprimentos de onda próximos da absorção máxima de p-nitroanilina pode modificar os resultados da análise. O teste Limulus Color KY da marca PYROSTAR™ permite a detecção quantitativa de endotoxinas pelo método colorimétrico.

LINHA DE PRODUTOS

Reagentes LAL	Acessórios LAL