Método LAL cinético-turbidimétrico para a detecção de endotoxinas (PYROSTAR™)

As endotoxinas bacterianas são um componente de lipopolissacarídeo (LPS) das membranas celulares de bactérias gram-negativas. A presença dos endotoxinas pode ser detectada por um método específico e eficiente, conhecido como o teste de Lisado de Amebócito Limulus (LAL).  O teste LALfoi desenvolvido na década de 1960 e é baseado na reação de coagulação da hemolinfa de caranguejos-ferradura atlânticos com antígenos presentes na superfície microbiana como as endotoxinas. Vários reagentes foram desenvolvidos para otimizar a eficiência de detecção do teste LAL e para tornar o processo mais rápido e conveniente.

PYROSTAR™ ES-F, fabricado pela FUJIFILM Wako, é um dos ativos que geralmente é utilizado para a detecção de endotoxinas bacterianas e contém Lisado de Amebócito Limulus, curdlana carboximetilado (CMC), tampões e cátions monovalentes e bivalentes.

PYROSTAR™ ES-F é muito sensível e é capaz de detectar endotoxinas em uma faixa quantitativa de 0,001 a 10 UE/ml, dependendo da sensibilidade usada. Este teste, além das instalações de fabricação associadas a ele, é totalmente licenciado pela FDA (Food and Drug Administration: Administração de Medicamentos e Alimentos).

PYROSTAR™ ES-F contém o reagente de lisado turbidimétrico liofilizado que permite a medição simultânea de múltiplas amostras. Também é um reagente único contendo curdlana carboximetilado (CMC) que foi co-liofilizado com o LAL para que o reagente seja completamente específico para as endotoxinas. Esta formulação patenteada evita a interferência de beta-glicanos presentes nas membranas das células bacterianas que podem afetar os resultados do teste LAL.

O método usado para a detecção de endotoxinas através do reagente PYROSTAR™ ES-F é o método cinético-turbidimétrico ou KTA. O teste cinético turbidimétrico pode avaliar quantitativamente o nível de endotoxinas de um produto com maior grau de precisão em relação a qualquer outra metodologia utilizada.

PYROSTAR™ ES-F pode ser adquirido em configurações multi-teste e teste único, com ou sem Controle padrão de endotoxinas (CPE). O CPE é um reagente liofilizado que foi desenvolvido a partir de E. coli e é utilizado como o teste padrão para confirmar a sensibilidade dos reagentes LAL, preparar os controles do teste e validar os métodos de teste de produtos.

O frasco de CPE contém 500 ng de endotoxinas. Cada frasco é testado em comparação com as endotoxinas de referência da FDA e o fator de conversão (UE/ml) é determinado. Para reconstituir o CPE, estique ligeiramente e retire a tampa de borracha do frasco para libertar o vácuo. Determine o volume de LRW a ser adicionado ao frasco para criar uma solução de 1.000 UE/mL. Adicione o volume determinado de LRW ao frasco e substitua a tampa de borracha.  Inverta e agite vigorosamente o frasco várias vezes durante 2 minutos.

ARTIGO EM DESTAQUE: Kits para o teste LAL usando o Método Colorimétrico

O CPE reconstituído pode ser armazenado por um mês a 2-10 °C. O CPE não deve ser armazenado em temperaturas abaixo de zero. Ao usar uma solução armazenada anteriormente, agite vigorosamente por um minuto antes de usar.

Os reagentes turbidimétricos cinéticos requerem um leitor de multitubo ou microplacas, juntamente com software de medição de endotoxinas para obter os valores quantitativos de endotoxinas. A detecção de endotoxinas com PYROSTAR™ ES-F é possível sem ser afetada pelos (1 → 3) - β-D -glicanos na amostra. Também, uma pequena quantidade da amostra pode ser usada para realizar o teste, uma vez que apenas um volume de 100 μL é necessário para o leitor de tubos e 50 μL para o leitor de microplacas. Além disso, devido aos tampões contidos no reagente, os valores de pH nas amostras têm um impacto insignificante, o que permite obter medições estáveis de endotoxina.

LINHA DE PRODUTOS LAL:

Acessórios LAL	Reagentes LAL