Mantendo o ambiente de teste livre de endotoxinas com baixo orçamento

Quando as endotoxinas bacterianas, que são pirogênios, ganham acesso à corrente sanguínea, causam febre e podem até levar a sepse e choque séptico.¹ Em um cenário de pesquisa, a contaminação por endotoxinas também tem consequências negativas, porque pode levar a resultados científicos errôneos e enganosos. As endotoxinas bacterianas estão localizadas na membrana externa das bactérias gram-negativas e são liberadas principalmente durante a lise bacteriana. Supostamente, uma única bactéria E. coli pode incluir até 2 milhões de moléculas de LPS (endotoxina).²

Devido aos graves riscos associados à contaminação por endotoxinas, o teste de endotoxinas foi estabelecido como um componente-chave do processo de fabricação de produtos parenterais. O ensaio de lisado de amebócito Limulus (LAL) é o melhor teste de endotoxina estabelecido que ganhou ampla aceitação. Baseia-se na incubação de um extrato de amebócito do caranguejo-ferradura com uma amostra testada para o conteúdo de endotoxina. Se a amostra contiver endotoxina, a coagulação sanguínea se desenvolve e um coágulo é formado que pode ser avaliado visualmente em um ensaio de gel-coágulo.³ A técnica de gel-coágulo é fácil de usar, não requer equipamentos caros e a interpretação de seus resultados é direta. Portanto, é adequado para uso como um ensaio qualitativo, quando o orçamento para testes é limitado. Para aplicações que requerem dados exatos quantitativos e cinéticos de endotoxina, podem ser usadas versões turbidimétricas ou cromogênicas do ensaio LAL.

A contaminação por endotoxinas do ambiente de teste pode ocorrer por várias vias, incluindo água, pele, ar, plástico ou vidros contaminados e soluções e reagentes de laboratório.⁴ Manter seu ambiente de teste livre de endotoxinas é um requisito fundamental para garantir resultados de testes confiáveis.

Desenvolvimento de uma estratégia abrangente para testes LAL e para a manutenção do ambiente de testes sem endotoxinas – Isso é importante, porque a prevenção da contaminação por endotoxinas é muito mais econômica do que o complicado processo de descontaminação de endotoxinas. A estratégia deve especificar o tipo de teste de endotoxina, a frequência dos testes e outras medidas planejadas para manter o ambiente livre de endotoxinas.

Garantir o acesso à água livre de endotoxinas – A água, que pode ser usada como solvente, para lavagem de amostras ou para limpeza de instrumentos, é uma das fontes mais importantes de contaminação por endotoxinas que pode ocorrer devido à purificação ou armazenamento insuficiente de água em condições inadequadas.⁵ Para garantir que a água não esteja contaminada, podem ser usados sistemas de ultrapurificação baseados em destilação de vidro ou osmose reversa. Além disso, o armazenamento prolongado da água de alta pureza deve ser evitado, e apenas recipientes não-pirogênicos devem ser usados para o armazenamento. Se nenhum sistema de ultrapurificação de água estiver disponível, água não pirogênica para injeção pode ser usada.

Empregando uma técnica asséptica para manipulação de amostras – A pele humana também pode ser uma fonte de contaminação por endotoxinas. Portanto, uma técnica asséptica deve ser empregada ao realizar testes de endotoxina e manusear amostras.

Usando artigos de plástico e artigos de vidro sem pirogênio – As endotoxinas têm alta afinidade e aderem fortemente a artigos de plástico e equipamentos. Além disso, a lavagem regular ou a autoclavagem não podem remover endotoxinas de forma confiável. No entanto, plásticos livres de pirogênios tornaram-se amplamente disponíveis comercialmente e seu uso diminui o risco de contaminação por endotoxinas. Além disso, a endotoxina pode ser removida de forma confiável de artigos de vidro usando despirogenização com calor seco a 180°C durante 4 h / durante a noite ou a 250°C durante 30 min.

Seleção de meios e aditivos testados para endotoxina – Meios, reagentes e aditivos testados por endotoxina devem ser usados como precaução contra a contaminação por endotoxinas. O teste pode ser realizado tanto pelo fabricante quanto internamente.

Referências

1. Sampath VP. Bacterial endotoxin-lipopolysaccharide; structure, function and its role in immunity in vertebrates and invertebrates. Agriculture and Natural Resources, 2018; 52 (2): 115-120. https://doi.org/10.1016/j.anres.2018.08.002.
2. Rhee SH. Lipopolysaccharide: basic biochemistry, intracellular signaling, and physiological impacts in the gut. Intest Res. 2014;12(2):90-5. doi: 10.5217/ir.2014.12.2.90.
3. FDA. Guidance for industry: pyrogen and endotoxins testing: questions and answers. June 2012.
4. Gorbet MB, Sefton MV. Endotoxin: The uninvited guest. Biomaterials. 2005;26(34):6811–6817. doi: 10.1016/j.biomaterials.2005.04.063.
5. FDA. Bacterial Endotoxins/Pyrogens. Conteúdo atualizado em 17/11/2014. https://www.fda.gov/inspections-compliance-enforcement-and-criminal-investigations/inspection-technical-guides/bacterial-endotoxinspyrogens.