Examinando Prós E Contras de Vários Métodos e Equipamentos de Teste LAL

A introdução de endotoxinas bacterianas no sistema circulatório humano pode induzir uma potente resposta pirogênica, resultando em febre, inflamação e, potencialmente, choque séptico. A membrana externa das bactérias Gram-negativas abriga endotoxinas, prevalentes em todo o ambiente. Consequentemente, o teste rotineiro de dispositivos médicos parenterais e produtos farmacêuticos para endotoxinas é obrigatório. Aceite globalmente e incluído na Farmacopeia Internacional, o ensaio LAL é o teste usado para detecção de endotoxinas e aprovado pelas autoridades regulatórias em todo o mundo.[1]
O lisado de amebócitos Limulus (LAL), um sistema de detecção altamente sensível para componentes da parede celular bacteriana e fúngica, está presente nas células sanguíneas do caranguejo-ferradura. Notavelmente, os ensaios LAL avançaram significativamente o controle de qualidade de dispositivos médicos e farmacêuticos, superando de forma eficaz o teste de pirogênio de coelho.[2]

Diferentes Categorias de Ensaio LAL

Gel-Coágulo

O teste de gel-coágulo do Lisado de Amebócitos Limulus (LAL) recebeu aprovação da Food and Drug Administration (FDA) durante a década de 1970 e desde então tem sido amplamente adotado como a técnica autorizada para detectar endotoxinas bacterianas. O teste LAL baseia-se na resposta de coagulação de um complexo enzimático derivado de células do caranguejo-ferradura, com endotoxinas bacterianas.[3]

Turbidimétrico
Após a adição do reagente de substrato LAL, cada amostra é completamente misturada e incubada dentro de um leitor turbidimétrico a 37 °C. Dispositivos espectrofotométricos, como o Toxinometer® e leitores de microplacas, facilitam o monitoramento automatizado durante todo o período de incubação subsequente. Existe uma correlação negativa entre o tempo de reação medido (desenvolvimento de turbidez) e a concentração de endotoxina dentro da amostra.[4]

Cromogênico
Métodos cromogênicos são utilizados para quantificar a resposta colorimétrica resultante da hidrólise enzimática de um substrato cromogênico [4]. Um novo método foi desenvolvido para criar um Reagente em Cascata recombinante (rCR), sintetizando e formulando as proteínas da cascata LAL.

Reagentes para teste LAL

Série PYROSTAR™ ES-F

Prós
Os reagentes PYROSTAR™ ES-F são projetados especificamente para reagir apenas com endotoxinas, não mostrando reatividade para (1→3)-β-D-glicano. Além disso, estes produtos têm uma dupla função, formulados para utilização tanto no teste gel-coágulo como no cinético-turbidimétrico (KTA). Configurações de teste único e multiteste estão disponíveis, oferecendo aos usuários uma escolha com base em suas necessidades. Esses reagentes são eficazes com amostras coloridas ou aquelas difíceis de quantificar usando o método KCA, oferecendo alterações de cores vibrantes para facilitar a visualização.
Contras
A série PYROSTAR™ ES-F pode mostrar uma diferença na concentração da amostra entre testes únicos e multitestes na solução de reação, o que pode levar a resultados imprecisos devido à mistura e/ou diluição desigual. Essa inconsistência pode ser observada como uma pequena variação nas leituras finais. Em um teste único, a amostra dissolve diretamente o reagente de lisado, enquanto em um multiteste, os dois são misturados. Isso significa que testes únicos podem ser mais afetados pela amostra.

Série Limulus Color KY

Prós
Os ensaios da Série Limulus Color KY são projetados para detectar endotoxinas especificamente e não reagem a (1→3)-β-D-glicano. A série oferece kits de teste múltiplos e únicos, empregando um substrato sintético. Uma cor amarela distinta indica de forma confiável a presença de endotoxinas, mesmo em baixas concentrações. Um Controle Padrão de Endotoxina (CPE) é fornecido com cada kit de reagente para fins de controle de qualidade. Esses reagentes são especialmente eficazes com amostras altamente turvas ou que apresentam desafios para quantificação usando o ensaio cinético-turbidimétrico (KTA), oferecendo maior clareza e resultados mais confiáveis.
Contras
Ao realizar o teste com o Toxinometer, é necessária uma quantidade maior de reagente LAL.

Limulus PS Teste Único

Prós
O Limulus PS Teste Único inclui frascos de teste único específicos para endotoxinas LAL e PyroSep™, uma suspensão inovadora de resina de afinidade que visa e remove endotoxinas das amostras, garantindo resultados precisos. Durante o uso do produto, a endotoxina na amostra é puxada para a coluna capilar, onde adere ao adsorvente PyroSep™ (histidina ligada a um suporte através de um espaçador), um processo que pode ser monitorado visualmente ou através de instrumentação. A amostra é cuidadosamente lavada para remover quaisquer substâncias inibitórias, revelando a endotoxina que foi adsorvida e agora pode ser medida usando o reagente LAL de formato teste único.
Contras
A complexidade deste teste supera a dos outros. Testadores experientes de endotoxinas acharão este método mais adequado devido à sua complexidade e exigência de conhecimento especializado.

Tampão ES

Prós
O Tampão ES, perfeito para LAL não tratado, tem como alvo específico as endotoxinas. Ao contrário de outros reagentes LAL no mercado, todos os reagentes LAL da FUJIFILM Wako LAL são projetados especificamente para atingir endotoxinas. Sem esse tampão, os testes podem gerar um falso positivo devido à interferência, relatando incorretamente a concentração de endotoxina da amostra.
Reagentes LAL, que não são da Wako, também são compatíveis.

Equipamento para Reagentes LAL

Água de Reagente LAL

Prós
Derivada da Água para Irrigação (WFI), a água de reagente LAL é adequada para atender a todos os requisitos de testes de endotoxinas. As diluições dos produtos são feitas cuidadosamente usando água de reagente LAL para garantir a confiabilidade e a reprodutibilidade dos dados obtidos com nossos reagentes LAL específicos para endotoxinas.
Contras
Mesmo uma pequena mudança no pH da ARL terá um impacto significativo nos resultados finais, alterando as reações químicas e potencialmente invalidando o experimento. A quantidade de ARL adicionada afeta significativamente a precisão da detecção de endotoxinas, influenciando a sensibilidade e a confiabilidade do teste. Mesmo pequenos desvios do volume recomendado para um teste específico podem causar resultados imprecisos e falso-negativos.

Tubos de Reação para Gel-Coágulo

Prós
O vidro de borosilicato de alta qualidade dos nossos tubos de reação Gel-coágulo passa por um processo de despirogenização a 250°C, resultando em um produto superior e livre de contaminantes. O tubo livre de endotoxinas resultante é otimizado para ensaios de gel-coágulo LAL, e seu design permite desempenho consistente com termoblocos e banhos-maria.
Contras
Os tubos de reação gel-coágulo são projetados exclusivamente para banho-maria ou termobloco e não são compatíveis com sistemas de medição Toxinometer.

Tubo-S de Teste Limulus

Prós
O Tubo-S de Teste Limulus é feito de vidro borossilicato de alta qualidade, despirogenizado a 250 °C, para testes confiáveis e estéreis. Os tubos precisamente curvados permitem que a quantidade ideal de luz passe pela amostra, possibilitando a medição precisa da concentração de endotoxina usando o método especificado. A curvatura é fundamental para resultados consistentes. Este tubo de vidro precisamente calibrado, com suas marcações gravadas, foi projetado para uso com o Sistema de Medição Toxinometer®.
O Tubo-S de Teste Limulus é versátil e pode ser utilizado para aplicações em banho-maria e termoblocos.
Contras
Os tubos são mais caros do que os tubos de gel-coágulo e são embalados com no máximo 100 tubos por pacote.

Resumo

Os reagentes LAL são aceites globalmente para detecção de endotoxinas em produtos farmacêuticos e dispositivos médicos, obtendo aprovação da FDA e sendo incluídos em farmacopeias em todo o mundo. Apesar de algumas deficiências, os avanços técnicos e a experiência melhoraram a qualidade de sua produção. 

Referências:

1. Mehmood, Y., What Is Limulus Amebocyte Lysate (LAL) and Its Applicability in Endotoxin Quantification of Pharma Products. 2019.
2. Tamura, H., J. Reich, and I. Nagaoka, Outstanding Contributions of LAL Technology to Pharmaceutical and Medical Science: Review of Methods, Progress, Challenges, and Future Perspectives in Early Detection and Management of Bacterial Infections and Invasive Fungal Diseases. Biomedicines, 2021. 9(5).
3. Meisel, J., Determination of Pyrogens: Comparison of Different Methods. Altex, 1995. 12(2): p. 89-92.
4. 4. Flórez, P., et al., Intralaboratory Validation of a Kinetic Turbidimetric Assay Based on Limulus Amebocyte Lysate (LAL) for Assessing Endotoxin Activity in Cow Milk. Animals (Basel), 2023. 13(3).