Evolução do BET ao longo do tempo e futuras possibilidades no campo do teste de endotoxinas

Os pirogênios, incluindo lipopolissacarídeos (LPS) de bactérias Gram-negativas (endotoxinas), são substâncias que podem causar febre e são consideradas contaminantes perigosos em produtos para a saúde. A interação direta de produtos médicos com sangue e órgãos tem o potencial de desencadear pirogênios, que ativam a imunidade inata do corpo. Isso pode resultar em febre alta, inflamação, danos aos tecidos e risco de sepse e choque.^[1]

Portanto, para atender aos requisitos regulatórios, os produtos médicos passam por testes de pirogenicidade como parte dos padrões e especificações de qualidade estabelecidos pela Farmacopeia.^[1]

Antecedentes históricos da Pirogenicidade

Burdon-Sanderson cunhou o termo "pirogênio" em 1875 para descrever uma substância hipotética encontrada em extratos livres de bactérias de carne em decomposição que induziam febre em animais quando injetados. A descoberta de Wechselman em 1911, de que as injeções de Salvarsan (um medicamento para sífilis) causavam febre em pacientes devido a bactérias em água destilada, levou a uma busca por uma solução. No entanto, o medicamento tinha que ser injetado e não podia ser administrado por via oral. Este medicamento tornou os fármacos injetáveis comuns e o controle de pirogênio essencial. ^[2].

Teste de pirogênio

Teste de Pirogênio de Coelho (RPT)

O primeiro teste de pirogênio de coelho foi desenvolvido por Hort e Penfeld em 1912, revelando que bactérias Gram-negativas causavam efeitos pirogênicos significativos em coelhos, enquanto bactérias Gram-positivas tiveram efeitos muito mais leves ^[2].

As endotoxinas são administradas em coelhos neste estudo, e rastreamos a ocorrência de reações febris caracterizadas por uma elevação na temperatura corporal. No entanto, a reação pode diferir da do corpo humano, resultando potencialmente em conclusões imprecisas.

O Ensaio de Lisado de Amebócitos Limulus (LAL)

O Ensaio de Lisado de Amebócitos Limulus (LAL), também conhecido como teste de endotoxina bacteriana (BET), é usado como substituto. Este método de teste é tanto econômico como amplamente reconhecido. O teste LAL envolve a mistura de sangue de Limulus com endotoxina bacteriana para formar um coágulo de gel chamado lisado. Os kits de teste de pirogênio atuais utilizam as propriedades turbidimétricas deste lisado para fins de testagem. O teste LAL provou ser 5 vezes mais sensível do que o Teste de Coelho para detecção de pirogênio.^[3]

O teste LAL para radiofármacos é modificado com solução de cloreto de cálcio para evitar resultados imprecisos de agentes quelantes. A presença desses agentes reduz a concentração de íons de cálcio divalentes livres no reagente LAL, o que inibe a formação do gel de coagulina e pode levar a um resultado falso negativo. Esta adaptação do método de teste LAL modificado é agora usada por hospitais e radiofarmácias centrais para testes de controle de qualidade de radiofármacos e kits refrigerados ^[4].

A Técnica do MAT (Teste de Ativação de Monócitos)

O MAT é usado principalmente para identificar e quantificar contaminantes pirogênicos de endotoxina e de não endotoxina. A ativação de monócitos humanos pode ocorrer devido a esses contaminantes, resultando na liberação de mediadores naturais ^[5]. O MAT envolve a exposição de monócitos humanos a pirogênios in vitro, o que ativa as células. Essa ativação desencadeia a liberação de citocinas pró-inflamatórias, que são posteriormente quantificadas pela técnica de ELISA ^[6].

O MAT é mais relevante fisiologicamente porque usa células humanas. Além disso, este sistema de detecção pode identificar e medir pirogênios de endotoxinas e de não endotoxinas com precisão quantitativa ^[7].

Perspectivas Futuras

A transição do RPT para o MAT tem sido desafiadora, exigindo imenso esforço e dedicação. A Direção Europeia para a Qualidade dos Medicamentos & Cuidados de Saúde, o Conselho da Europa e a Parceria Europeia para Abordagens Alternativas aos Testes em Animais organizaram conjuntamente uma conferência internacional intitulada "O futuro dos testes de pirogenicidade: eliminação gradual do teste de pirogênio de coelho". A conferência destacou a missão da Farmacopeia Europeia de eliminar o RPT dos seus textos até 2026, tornar a adoção do MAT mais eficiente e identificar quaisquer lacunas na erradicação do RPT.^[8]

Para cumprir as diretrizes da FDA, é essencial realizar a validação específica do produto para avaliar a adequação do uso da técnica do MAT para avaliar uma determinada substância ou material de teste. O processo de validação deve abranger vários testes, como testes de interferência e detecção precisa de pirogênio em cada amostra, além de garantir o contato direto entre o dispositivo e os monócitos.^[9]

Referências 

1. Spoladore, J., et al., Standardized pyrogen testing of medical products with the bacterial endotoxin test (BET) as a substitute for rabbit Pyrogen testing (RPT): A scoping review. Toxicol In Vitro, 2021. 74: p. 105160.
2. Hartung, T., The human whole blood pyrogen test – lessons learned in twenty years. ALTEX - Alternatives to animal experimentation, 2015. 32(2): p. 79-100.
3. Karesh, S.M.J.J.o.n.m.t., Sterility and pyrogen testing of radiopharmaceuticals. 1989. 17(3): p. 156-159.
4. Mitra, A., et al., Limulus amebocyte lysate testing: adapting it for determination of bacterial endotoxin in 99mTc-labeled radiopharmaceuticals at a hospital radiopharmacy. J Nucl Med Technol, 2014. 42(4): p. 278-82.
5. Solati, S., T. Zhang, and S. Timman, The monocyte activation test detects potentiated cytokine release resulting from the synergistic effect of endotoxin and non-endotoxin pyrogens. Innate Immun, 2022. 28(3-4): p. 130-137.
6. Perdomo-Morales, R., et al., Monocyte activation test (MAT) reliably detects pyrogens in parenteral formulations of human serum albumin. Altex, 2011. 28(3): p. 227-35.
7. Carson, D., et al., Development of a Monocyte Activation Test as an Alternative to the Rabbit Pyrogen Test for Mono- and Multi-Component Shigella GMMA-Based Vaccines. 2021. 9(7): p. 1375.
8. Cirefice, G., et al., The future of pyrogenicity testing: Phasing out the rabbit pyrogen test. A meeting report. Biologicals, 2023. 84: p. 101702.
9. Sandle, T., Orientação da FDA sobre testes de pirogênios e endotoxinas.