Estratégias para medir endotoxina em amostras difíceis

A contaminação por endotoxinas de produtos terapêuticos parenterais pode levar a consequências graves, incluindo febre, sepse e choque séptico. Dessa forma, o teste de endotoxina foi estabelecido como um componente rotineiro e crítico da fabricação e controle de qualidade de produtos farmacêuticos parenterais e dispositivos médicos.

O ensaio de lisado de amebócito Limulus (LAL) é o teste melhor estabelecido para avaliação de endotoxinas.¹ Ele depende da incubação de um extrato de amebócitos do caranguejo-ferradura com uma amostra examinada para contaminação por endotoxinas. Se a endotoxina estiver presente na amostra analisada, um coágulo é formado. A técnica de ensaio LAL mais tradicional é o ensaio qualitativo de gel-coágulo. Posteriormente, foram desenvolvidas versões quantitativas do ensaio LAL, incluindo os ensaios LAL cromogênico e turbidimétrico.

A precisão e a confiabilidade do ensaio LAL foram confirmadas. No entanto, uma variedade de fatores relacionados aos produtos testados, componentes da mistura de ensaio, meio ambiente e até recipientes podem causar desafios de teste e resultados enganosos, incluindo interferência de amostra ou mascaramento de endotoxinas.^2–4 Fatores que podem interferir no desempenho apropriado do ensaio LAL incluem inibidores químicos (como ácido etilenodiaminotetracético, EDTA); agentes desnaturantes (como ácidos concentrados, bases, sais inorgânicos ou solventes orgânicos); moléculas de álcool base; um valor de pH fora da faixa ideal; mascaramento de endotoxinas (por substâncias como excipientes, surfactantes, quelantes ou óxido de N-dimetilamina); ou absorção da endotoxina para superfícies de recipientes.¹ Para dispositivos médicos, o revestimento anticoagulante, o teor de metais pesados ou a presença de partículas podem interferir nos resultados do teste.² Para produtos avaliados com o método cromogênico, os componentes da mistura de ensaio que viram uma cor específica quando entram em contato com o reagente LAL também podem interferir nos resultados do teste.¹ Para amostras examinadas com o método turbidimétrico, produtos turvos ou suspensos também podem levar à interferência da amostra.¹ 

Várias estratégias foram desenvolvidas para mitigar a influência de fatores que causam interferência na amostra ou mascaramento de endotoxinas:

1. Diluição apropriada da amostra – Se não houver atividade interferente ou intensificadora no ensaio LAL, recomenda-se a triagem de produtos não diluídos. No entanto, se os ingredientes do produto interferirem com o ensaio LAL, o produto deve ser diluído para superar a interferência ou intensificação. Recomenda-se identificar a menor diluição do produto que neutralizaria o efeito interferente, mas ainda assim permitiria a determinação de endotoxinas.²
2. Digestão, adição de tampão, filtração ou centrifugação são outros tratamentos potenciais para a mitigação da interferência de teste para dispositivos médicos.² Sua implementação deve ser baseada em uma avaliação cuidadosa dos fatores de interferência e validação das condições de teste.
3. Manutenção de uma faixa de pH ideal  – A faixa de pH ideal para o ensaio LAL está na faixa de 6,0-8,0, e as condições de teste devem ser mantidas dentro dessa faixa para garantir resultados consistentes.
4. Garantia da homogeneidade da amostra – Suspensão em amostras podem causar problemas de interferência. Portanto, um esforço deve ser feito para garantir a homogeneidade da amostra. Neste contexto, não é recomendado agrupar amostras de diferentes etapas do processo de fabricação, uma vez que sua homogeneidade pode ser difícil de ser garantida.²
5. Ajuste da diluição máxima válida (MVD) para amostras agrupadas – Em certos casos, unidades de pequeno volume de produto farmacêutico acabado podem ser agrupadas em uma amostra composta para uma análise de ensaio LAL. Nesses casos, a MVD deve ser ajustada para um valor proporcionalmente menor dividindo a MVD calculada para uma amostra individual pelo número total de amostras agrupadas.²
6. Uso de kits e recipientes de amostra bem caracterizados por seu desempenho no ensaio LAL – Como os componentes da mistura de ensaio LAL e recipientes de amostra também podem afetar negativamente os resultados do teste,⁴ apenas kits de teste e recipientes de amostra bem caracterizados devem ser usados.

Fontes de literatura

1. Wheeler, A. Comparing endotoxin detection methods. Pharmaceutical Technology 2017;41:58–62.
2. FDA. Guidance for industry: pyrogen and endotoxins testing: questions and answers. Junho 2012.
3. Reich J, Lang P, Grallert H, Motschmann H. Masking of endotoxin in surfactant samples: Effects on Limulus-based detection systems. Biologicals. 2016;44(5):417-22. doi: 10.1016/j.biologicals.2016.04.012.
4. Bech Ørving R, Carpenter B, Roth S, Reich J, Kallipolitis B, Sonne-Hansen J. Bacterial Endotoxin Testing-Fast Endotoxin Masking Kinetics in the Presence of Lauryldimethylamine Oxide. Microorganisms. 2020;8(11):1728. doi: 10.3390/microorganisms8111728.