Ensaio LAL tradicional vs LAL recombinante (sintético)
Endotoxinas bacterianas como pirogênios poderosos
As endotoxinas bacterianas são amplamente disseminadas no ambiente. No entanto, as endotoxinas também são pirogênios poderosos que podem levar ao desenvolvimento de febre, inflamação e até choque séptico, se tiverem acesso à corrente sanguínea.1
Para evitar esses riscos graves, o teste de endotoxina tem sido rotineiramente implementado no processo de fabricação de medicamentos farmacêuticos parenterais e dispositivos médicos. Além disso, o ensaio de lisado de amebócito Limulus (LAL) foi estabelecido como o padrão ouro para o teste de endotoxina.
O ensaio LAL tradicional
O ensaio LAL tradicional detecta a contaminação por endotoxina através da incubação de proteína extraída do sangue de caranguejo-ferradura com uma amostra contaminada com endotoxina, o que inicia a formação de uma reação de coagulação. Pode ser realizado como um teste de gel-coágulo qualitativo com base na visualização de coágulos ou como um ensaio turbidimétrico ou cromogênico quantitativo, cujos resultados podem ser registrados com um Toxinometer®️ ou um leitor de microplacas, respectivamente.
O ensaio LAL de gel-coágulo é usado para a detecção qualitativa, mas rápida e sensível de endotoxina através da visualização de um coágulo formado. No entanto, não permite a quantificação de endotoxinas.
O ensaio LAL turbidimétrico (KTA) permite a quantificação de endotoxinas com base na turbidez (nebulosidade) da amostra analisada, que ocorre após a clivagem do substrato enzimático, mas antes da formação do gel.
O ensaio LAL cromogênico (KCA) quantifica a endotoxina detectando e quantificando fotometricamente a liberação cromogênica causada pela clivagem de um substrato cromogênico.
Riscos ambientais associados ao ensaio LAL tradicional
A produção do reagente LAL tradicional requer a captura e o sangramento de caranguejos-ferradura; no entanto, o desenvolvimento de alternativas recombinantes (sintéticas) para o teste de endotoxina reduzirá qualquer impacto ambiental que possa existir. Isso está de acordo com a estrutura 3Rs para a ciência dependente de animais, que reflete o objetivo de substituir (replace), reduzir (reduce) e refinar (refine) o uso de animais sempre que possível.3
Ensaios de endotoxina recombinante (sintética) atualmente disponíveis
Ensaios baseados em fator C recombinante – Ofator C é o componente inicial da cascata de coagulação de caranguejos-ferradura. É induzido por endotoxinas e tem sido utilizado para o desenvolvimento de ensaios de endotoxinas recombinantes. Os ensaios baseados em fator C recombinante não requerem o uso de amebócitos do caranguejo-ferradura e podem detectar endotoxina com alta sensibilidade e especificidade.
Ensaio LAL sintético Pyrostar – FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation desenvolveu um novo reagente recombinante de detecção de endotoxina 100% livre de animais, PYROSTAR™ Neo. Ele imita a reação em cascata dos reagentes LAL tradicionais com três fatores recombinantes (Fator C, Fator B e enzima pró-coagulante) e oferece alta sensibilidade e especificidade. O PYROSTAR™ Neo depende do grupo cromogênico pNA para quantificar a endotoxina com um método colorimétrico sensível compatível com um leitor de placas de absorbância. Além disso, este método eliminou o risco de falsos positivos relacionados a (1-->3)ß-D-glicano através do uso de reagentes específicos de endotoxina.
Ponto-chave a ser lembrado
O ensaio LAL pode determinar qualitativa ou quantitativamente a contaminação por endotoxinas com alta sensibilidade e especificidade. No entanto, os ensaios LAL tradicionais dependem do sangramento de caranguejos-ferradura, o que pode ter um impacto ambiental. O desenvolvimento de testes recombinantes para determinação de endotoxinas, como ensaios de LAL recombinante, permite a detecção de endotoxinas sem comprometer a sensibilidade e especificidade do ensaio, eliminando quaisquer possíveis efeitos no meio ambiente.
Fontes de literatura
- Sampath VP. Bacterial endotoxin-lipopolysaccharide; structure, function and its role in immunity in vertebrates and invertebrates. Agriculture and Natural Resources, 2018; 52 (2): 115-120.
- Maloney T, Phelan R, Simmons N. Saving the horseshoe crab: A synthetic alternative to horseshoe crab blood for endotoxin detection. PLoS Biology, 2018; 16 (10): e2006607.
- Gorman R. Atlantic Horseshoe Crabs and Endotoxin Testing: Perspectives on Alternatives, sustainable Methods, and the 3Rs (Replacement, Reduction, and Refinement). Frontiers in Marine Science, 2020; 7: fmars.2020.582132.
