Endotoxina: Um Contaminante Insidioso de Cultura Celular

Ao cultivar qualquer tipo de célula em um ambiente de laboratório, evitar a contaminação é sempre a preocupação principal. Os contaminantes biológicos costumam ser o foco de tais esforços e também podem ser os mais simples de detectar e evitar.

Por exemplo, a maior parte da contaminação bacteriana ou fúngica pode ser detectada visualmente no meio de cultura de células e evitada usando tratamentos com antibióticos. Outros contaminantes biológicos, como micoplasma ou outras linhagens celulares, são mais difíceis de detectar, mas ainda podem ser monitorados por meio de kits de teste disponíveis no mercado.

Em contraste com a contaminação biológica, a contaminação química recebe relativamente pouca atenção e é mais difícil de detectar e evitar. Entre os contaminantes químicos mais insidiosos estão as endotoxinas, um tipo de lipopolissacarídeo que forma a parede celular externa das bactérias Gram-negativas. Ao contrário das bactérias vivas, as endotoxinas não podem ser observadas visualmente em meios de cultura celulares. Além disso, as endotoxinas não podem ser eliminadas com antibióticos, exigindo, em vez disso, soluções especializadas de remoção de endotoxinas.

A contaminação por endotoxinas pode atrapalhar muito um experimento in vitro, particularmente aqueles envolvendo células imunológicas. Os macrófagos apresentam aumento da secreção de IL-6 em resposta às endotoxinas, enquanto as células T apresentam aumento da proliferação e produção de linfocina.

As células não imunes também podem estar sujeitas a desregulação por endotoxinas. Embora as endotoxinas sejam classicamente vistas como agindo através do receptor CD14, as células sem esse receptor ainda podem mostrar respostas fortes à contaminação por endotoxinas. Por exemplo, um estudo relatou que os miócitos cardíacos experimentam disfunção contrátil após a exposição a endotoxinas. Outros estudos relataram produção de proteína alterada em células CHO e eficiência clonal alterada em células epiteliais ureterais.

Além disso, a sensibilidade de diferentes linhagens celulares à contaminação por endotoxinas é altamente variável. Algumas linhagens celulares mostram desregulação em menos de 1ng/mL de endotoxina, enquanto outras requerem concentrações muito mais altas de até 5000 ng/mL. Também foi teorizado que as linhagens celulares cultivadas por muitos anos em cultura (como células HeLa e CHO) podem ter sido selecionadas naturalmente para resistência à endotoxina ao longo do tempo. Com base nisso, é difícil determinar um limite seguro universal para a contaminação por endotoxinas.

Fontes potenciais de contaminação por endotoxinas incluem água, meios de cultura de células, soros, vidrarias e utensílios de plástico. As endotoxinas são altamente resistentes à autoclavagem e à irradiação, o que significa que podem estar presentes mesmo na ausência de bactérias viáveis. Sua alta hidrofobicidade também lhes dá uma forte afinidade por utensílios de plástico.

Ao trabalhar com células em cultura, é crucial comprar produtos com baixo teor de endotoxinas, quando disponíveis. No entanto, uma vez que a contaminação por endotoxina pode surgir após a abertura dos reagentes, ou ser transferida de vidraria/utensílios de plástico, também é importante realizar testes regulares de endotoxina.

A opção de teste de endotoxina mais popular é o teste de lisado de amebócito Limulus (LAL), que é derivado do sangue de caranguejos-ferradura. Na presença de endotoxinas, uma enzima do teste inicia uma cascata de coagulação, que pode ser usada para quantificar os níveis de endotoxinas com alta precisão e sensibilidade.

Recomenda-se realizar testes regulares de LAL em todos os reagentes de cultura de células, particularmente antes de qualquer experimento in vitro crucial ou em grande escala. A facilidade e o baixo custo necessário para o teste LAL o torna uma opção ideal para testes frequentes de endotoxinas.

Fonte: https://www.corning.com/catalog/cls/documents/application-notes/TC-305.pdf