Determinação de endotoxinas no plasma sanguíneo pelo método de LAL

O ensaio de LAL (Limulus amebocytes lisate ou em português lisado de amebócitos de Limulus), como comentamos anteriormente em outros artigos deste blog, utiliza a hemolinfa do caranguejo ferradura, Limulus Polyphemus, para a determinação de endotoxinas bacterianas. As endotoxinas bacterianas são o pirogênio mais frequente que pode contaminar as amostras farmacológicas e de outros tipos. Estas endotoxinas bacterianas provêm das bactérias Gram-negativas que são muito abundantes na natureza, portanto, é muito comum encontrar estes lipopolissacarídeos em qualquer meio.

A presença de endotoxinas bacterianas no plasma sanguíneo, como evidência da destruição da parede celular de bactérias Gram-negativas, está relacionada com a possibilidade de formação de adenomas precursores de câncer colorretal, assim como de outros tipos de câncer e diversas doenças que ocorrem devido ao desequilíbrio da microbiota do trato gastrointestinal.

Os cientistas estudaram os efeitos que uma alta concentração de endotoxinas bacterianas pode ter no plasma sanguíneo, levando à conclusão de que essas substâncias, ao se unirem com as proteínas de união de LPS, formam o complexo CD14, que por sua vez ativa os receptores que provocam respostas inflamatórias inatas. Ao se desenvolver esses processos, monócitos e macrófagos são ativados e citocinas pro inflamatórias são segregadas, como o fator alfa de necrose tumoral e tipos diferentes de interleucinas, fazendo com que uma abundância de bactérias Gram-negativas na microbiota intestinal possam conduzir à formação de moléculas responsáveis pela proliferação celular e os danos do DNA que resultam na formação do câncer. A detecção dos lipopolissacarídeos (LPS) no plasma sanguíneo, assim como em outras amostras biológicas e laboratoriais, pode se desenvolver mediante o método LAL.

Outra utilidade que a detecção de endotoxinas bacterianas apresenta no plasma sanguíneo é o estudo do caminho do vírus da imunodeficiência humana (VIH) até a doença que provoca este vírus conhecida como AIDS (síndrome da imunodeficiência adquirida). Considera-se que a ativação deste vírus traz um transtorno à imunidade intestinal e causa a translocação microbiana dos produtos bacterianos e a forma que se pode medir este processo é através da determinação de LPS no plasma sanguíneo. Através do ensaio de LAL se comprovou que as pessoas portadoras do vírus da imunodeficiência humana apresentam níveis maiores de endotoxinas plasmáticas, feito que é consistente com estudos realizados com primatas, onde também se observou que estes animais quando são portadores dos vírus da imunodeficiência de macacos possuem altos níveis de LPS no sangue.

Para desenvolver o ensaio de lisado de amebócitos de Limulus no plasma sanguíneo se utiliza o método colorimétrico. Pode-se quantificar a gelificação que é produzida na hemolinfa do caranguejo ferradura pela presença de endotoxinas bacterianas, usando um corante como a paranitroanilina, junto a uma molécula de peptídeo. A junção que é produzida entre o peptídeo e a p-nitroanlina se rompe devido à cascata de reações enzimáticas que os LPS desencadeiam na hemolinfa, que tem como produto final a coagulima, proteína responsável pela formação do gel característico desta reação. A concentração de corante no meio é medida utilizando um espectrofotômetro e é proporcional à quantidade de endotoxinas presente no meio. As medidas de concentração do corante podem ser feitas em intervalos de tempo fixos, uma vez que se tenha acrescentado o reagente de LAL à amostra de plasma (que daria como resultado o que se conhece como ensaio de LAL através do método cromogênico cinético) ou realizar-se somente uma medida ao terminar a reação enzimática e o gel já esteja formado (neste caso se estaria utilizando o método cromogênico de endpoint).

VER TAMBÉM: Deteção De Endotoxinas Mediante O Ensaio De LAL, Método Cromogénico

A Divisão de LAL comercializa um teste para realizar o ensaio de LAL através do método colorimétrico chamado Teste Limulus Color KY, com o qual se pode medir quantitativamente a quantidade de endotoxinas bacterianas que contém uma amostra.

Quando o ensaio de LAL é feito no plasma sanguíneo amostras de sangue são coletadas previamente em tubos que já contém uma solução de EDTA, que impede a coagulação do sangue, e em seguir, são centrifugados. Se os tubos serão armazenados antes de se realizar o ensaio devem ser conservados em temperaturas abaixo dos70º, para prevenir erros nos resultados. Outro aspecto a ser levado em consideração, é que o plasma deve estar livre de glóbulos vermelhos, que também são outros interferentes potenciais que por estarem presentes nas amostras provocariam falsos resultados.

Bibliografia:

1) Kostic AD, Gevers D, Pedamallu CS, Michaud M, Duke F, Earl AM, Ojesina AI, Jung J, Bass AJ, Tabernero J, Baselga J, Liu C, Shivdasani RA, Ogino S, Birren BW, Huttenhower C, Garrett WS, Meyerson M, Genome Res., 22, 2, 292-298, 2012.

2) Atreya R, Neurath MF, Curr Drug Targets, 9, 5, 369-374, 2008.

3) Giorgi JV, Hultin LE, McKeating JA, Johnson TD, Owens B, Jacobson LP, Shih R, Lewis J, Wiley DJ, Phair JP, Wolinsky SM, Detels R, J Infect Dis., 179 (4), 859-870, 1999.

4) W4, 1999.

5) K, 2011.

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