Detecção de endotoxina específica e confiável usando os reagentes de lisado de amebócito Limulus (LAL) PYROSTAR ES-F

Mesmo quantidades mínimas de endotoxina causam inflamação, febre e danos aos tecidos, quando injetadas ou implantadas em humanos, e podem levar à sepse e até à morte. As endotoxinas são um componente integral da membrana externa das bactérias gram-negativas e, portanto, são onipresentes no meio ambiente. Para prevenir os efeitos potencialmente deletérios da administração de endotoxinas parenterais, o teste de endotoxinas foi introduzido como uma etapa crítica no desenvolvimento e controle de qualidade de produtos biofarmacêuticos e de dispositivos médicos. O teste de lisado de amebócito Limulus (LAL) é o método mais amplamente estabelecido para a detecção de endotoxinas. Sua utilidade foi comprovada em vários estudos e na prática. No entanto, o teste LAL também está associado a desafios, incluindo o risco de resultados falso-positivos e falso-negativos.¹ Essas limitações do teste LAL têm implicações práticas importantes, porque os resultados dos testes falso-positivos e falso-negativos têm grande probabilidade de levar a interpretações errôneas dos achados e interferir no cuidado adequado do paciente.²

O desenvolvimento dos reagentes LAL PYROSTAR ES-F da Wako para a detecção de endotoxinas representa um grande avanço no que diz respeito à detecção confiável e específica de endotoxinas bacterianas, reduzindo as taxas de resultados falso-positivos e falso-negativos do teste LAL. Os reagentes LAL PYROSTAR ES-F podem ser usados para a detecção qualitativa e quantitativa de endotoxinas usando um método gel-coágulo ou um cinético-turbidimétrico, respectivamente.

Redução da taxa de falso-positivo do teste LAL através da inclusão de curdlano carboximetilado (CMC) no Tampão ES-F

Os resultados falso-positivos obtidos no teste LAL podem ser causados por contaminação com produtos fúngicos e de celulose contendo (1,3)-beta-D-glicano.^1,3 Notavelmente, (1,3)-beta-D-glicano e endotoxinas induzem a formação de coágulos no teste LAL através de duas vias distintas. (1,3)-beta-D-glicano estimula a formação de coágulos por meio da ativação do fator G, levando a um resultado falso-positivo. No entanto, as endotoxinas estimulam a formação de coágulos por meio da ativação do fator C, que por sua vez ativa o fator de coagulação B. Notavelmente, (1,3)-beta-D-glicano é inofensivo nas baixas concentrações que causam resultados falso-positivos no teste LAL , embora possa exercer efeitos nocivos em altas concentrações.

O tampão ES-F reduz a taxa de resultados falso-positivos no teste LAL através da adição de alta concentração de curdlano carboximetilado (CMC). O CMC está intimamente relacionado ao (1,3)-beta-D-glicano e interage com o fator G, mas não o ativa. Essa interação, por sua vez, impede a ativação do fator G pelo (1,3)-beta-D-glicano. Inicialmente, a Wako PYROSTAR desenvolveu o tampão ES contendo CMC, que torna o reagente LAL específico para a endotoxina quando usado para sua reconstituição. Posteriormente, foi introduzida a formulação do tampão PYROSTAR ES-F da Wako, que contém CMC e LAL co-liofilizados, otimizando ainda mais a conveniência e facilidade de uso do reagente. 

Redução da taxa de resultados falso-negativos e falso-positivos no teste LAL através das propriedades de tamponamento ES-F

Notavelmente, o tampão PYROSTAR ES-F também diminui a taxa de resultados falso-positivos e falso-negativos induzidos por desvios de pH via suas propriedades de tamponamento. Os reagentes LAL funcionam corretamente apenas em um ambiente neutro, porque um ambiente ácido ou básico pode causar resultados falso-negativos e falso-positivos. Tanto os ácidos quanto as bases podem desnaturar e inativar os fatores envolvidos no teste LAL, levando a resultados falso-negativos. No entanto, mesmo um ambiente levemente ácido (pH 6) ou básico (pH 8) também foi associado a um aumento da taxa de falso-positivo em comparação com um ambiente neutro (pH 7).⁴ O tampão ES-F usa Tris como um componente tampão, que neutraliza ácidos e bases, mantendo de maneira resiliente a faixa de pH ideal da mistura de reagentes e diminuindo a taxa de resultados falso-negativos e falso-positivos no teste LAL.

Reagentes LAL PYROSTAR ES-F como um método altamente confiável e específico para teste de LAL

Testes de endotoxinas confiáveis e específicos são essenciais para garantir a segurança de produtos biofarmacêuticos e de dispositivos médicos. O desenvolvimento do Tampão ES-F como um componente dos reagentes LAL PYROSTAR ES-F reduz bastante as taxas de resultados falso-positivos e falso-negativos no teste LAL, criando um reagente LAL incrivelmente específico e promovendo a segurança do paciente.

Fontes de literatura

1. Nalepka JL, Greenfield EM. Detection of bacterial endotoxin in human tissues. Biotechniques. 2004;37(3):413–417. https://doi.org/10.2144/04373ST06
2. Jackson BR. The dangers of false-positive and false-negative test results: false-positive results as a function of pretest probability. Clin Lab Med. 2008;28(2):305–319. doi: 10.1016/j.cll.2007.12.009.
3. Anderson J, Eller M, Finkelman M, Birx D, Schlesinger-Frankel S, Marovich M. False positive endotoxin results in a DC product caused by (1-->3)-beta-D-glucans acquired from a sterilizing cellulose filter. Cytotherapy. 2002;4(6):557–559. doi: 10.1080/146532402761624728.
4. Lourenço FR, Botelho Tde S, Pinto Tde J. How pH, temperature, and time of incubation affect false-positive responses and uncertainty of the LAL gel-clot test. PDA J Pharm Sci Technol. 2012;66(6):542–546. doi: 10.5731/pdajpst.2012.00887.