Contaminações Por Endotoxinas E Suas Consequências Em Novos Tratamentos De CRISPR/Cas9

O que é CRISPR/Cas9?

A técnica de edição do genoma CRISPR/Cas9 usa Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas (CRISPR) e a proteína associada a CRISPR 9 (CRISPR/Cas9).

Essa tecnologia permite a edição eficiente e econômica do genoma, permitindo a fácil manipulação de genes em células e organismos. Os laboratórios a utilizam para uma variedade de propósitos, incluindo a geração rápida de modelos celulares e animais, a execução de triagens genômicas funcionais e a geração de imagens em tempo real do genoma celular.

Foi provado que esta técnica pode corrigir com sucesso o DNA defeituoso em camundongos, tratando efetivamente seus distúrbios genéticos, e também pode manipular embriões humanos. As aplicações clínicas atuais exploram o desenvolvimento de métodos de tratamento para HIV, fibrose cística, hemofilia e câncer.[1]

Contaminação por endotoxina em CRISPR/Cas9

Bactérias E. coli são comumente usadas para expressar proteínas Cas9 terapêuticas devido à sua relação custo-benefício e alto rendimento de produção. Apesar disso, essas bactérias gram-negativas também geram lipopolissacarídeos (LPS) que são considerados subprodutos indesejáveis da endotoxina. Essas endotoxinas podem causar inflamação grave ao induzir uma resposta imune humana.[2, 3]

Portanto, é importante dar atenção especial à produção de proteína Cas9. Isso nos permite desenvolver usos potenciais de Cas9 como uma proteína terapêutica no tratamento clínico.

Efeitos da Contaminação por Endotoxina

A segurança e a eficácia da terapia podem ser afetadas pelas respostas imunes às proteínas usadas em tratamentos médicos, o que também pode levar a efeitos adversos graves nos pacientes, às vezes até com risco de morte.

Nas avaliações de risco de imunogenicidade, as proteínas derivadas de micróbios são classificadas como de alto risco. As proteínas recombinantes produzidas por E. coli geralmente contêm endotoxinas devido à alta presença de lipopolissacarídeos (LPS) na parede celular bacteriana. [3]

Preocupações surgiram devido a relatos sobre as reações imunes às proteínas Cas9, sugerindo que a imunogenicidade poderia representar obstáculos para a implementação clínica da edição do genoma CRISPR.

Teste de Endotoxina com método LAL

O teste LAL, que utiliza o extrato aquoso de células sanguíneas de Limulus polyphemus, é amplamente empregado para a identificação in vitro de endotoxinas bacterianas. É amplamente considerado como o método mais confiável e sensível. Desde a sua aprovação pela FDA na década de 1970, o teste LAL de gel-coágulo ganhou ampla adoção como o método oficial para a detecção de endotoxinas bacterianas.[4]

O ensaio LAL é altamente sensível e capaz de detectar níveis de endotoxinas entre 0,01 e 10 UE/dispositivo em produtos farmacêuticos ou dispositivos médicos, garantindo a conformidade com as diretrizes da FDA. [5]

É importante detectar o nível de endotoxina na proteína Cas9 para garantir a implementação eficaz da técnica de edição do genoma CRISPR/Cas9.

Referências

1. Redman M, King A, Watson C, King D: What is CRISPR/Cas9? Archives of disease in childhood Education and practice edition 2016, 101(4):213-215.
2. Singpant P, Tubsuwan A, Sakdee S, Ketterman AJ, Jearawiriyapaisarn N, Kurita R, Nakamura Y, Songdej D, Tangprasittipap A, Bhukhai K et al: Recombinant Cas9 protein production in an endotoxin-free system and evaluation with editing the BCL11A gene in human cells. Protein Expression and Purification 2023, 210:106313.
3. Simhadri V, McGill J, Sauna Z: Endotoxin contamination in commercially available Cas9 proteins potentially induces T-cell mediated responses. Gene Therapy 2021, 30:1-6.
4. Tamura H, Reich J, Nagaoka I: Outstanding Contributions of LAL Technology to Pharmaceutical and Medical Science: Review of Methods, Progress, Challenges, and Future Perspectives in Early Detection and Management of Bacterial Infections and Invasive Fungal Diseases. Biomedicines 2021, 9(5).
5. Sandle T: Orientação da FDA sobre testes de pirogênios e endotoxinas.