Comparando o método de LAL com o ensaio de pirogênio em coelhos

O método LAL (Lisado de amebócitos de Limulus) substituiu o ensaio de pirogênios que se realizava utilizando coelhos, tanto em experiências que ocorrem em pesquisas, como na indústria farmacêutica, alimentícia e outras, quando se quer comprovar o conteúdo de endotoxinas que existe em uma amostra. As endotoxinas bacterianas recebem este nome por serem substâncias que formam parte da parede celular das bactérias Gram-negativas que causam toxicidade nos humanos e em muitos animais. Como veremos neste artigo, existem varias razões pelas quais o método de LAL é utilizado para a detecção de endotoxinas bacterianas, preferencialmente ao método com coelhos.

O ensaio de pirogênios em coelhos se baseia na medida do aumento da temperatura do coelho ao ser injetado com um produto que pode conter um agente contaminante do tipo pirogênico. Os pirogênios, como seu nome indica, são todas aquelas substâncias que causam o aumento da febre, também chamada pirexia. Os coelhos apresentam uma elevação de temperatura ao entrar em contato com os pirogênios, similar à dos seres humanos. Por este motivo e por serem animais utilizados nos laboratórios com diversas finalidades foram escolhidos para se realizar este teste.

As desvantagens do teste de pirogênios usando coelhos, para a determinação de endotoxinas bacterianas são numerosas:

• É um ensaio demorado, pois se deve medir a temperatura do animal durante as 3 horas seguintes, depois da injeção, em intervalos aproximados de 30 minutos.

• Devem ser usados 3 animais para cada solução de teste, e estes não devem apresentar elevação da temperatura nas duas semanas anteriores e não deve se utilizar os mesmos animais até terem passado dois dias do ensaio. Além disso, devem-se escolher vários animais para o grupo de controle que tenham uma temperatura estável já que se deve ter à disposição uma grande quantidade de coelhos para desenvolver o teste, sobretudo nas indústrias com grande volume de produção e se pode considerar um teste trabalhoso.

• Se for considerado que muitas outras substâncias, tanto endógenas quanto exógenas podem causar a elevação da temperatura nos coelhos, este é um ponto bastante limitante para se utilizar este ensaio como determinação de endotoxinas em uma amostra. Embora seja difícil que este teste tenha como resultado um falso positivo devido a substâncias endógenas, pelo grande número de sujeitos usados para o ensaio, é muito comum que se ofereça resultados errados quando as amostras se encontram contaminadas por vírus, fungos ou outro tipo de substância que pode causar febre em todos os animais do ensaio.

• É um método inadequado para determinar pirogênios em medicamentos como os esteroides, os utilizados em quimioterapia e outros que pertencem ao grande grupo de substâncias que quando são administradas ao organismo podem responder com mecanismos que causam o aumento da temperatura, sendo esta, outras dos grandes limitadores deste ensaio quando se estão fazendo pesquisas com medicamentos ou se trata do controle de endotoxinas na indústria farmacêutica.

• Uma desvantagem muito grande é o fato de não poder quantificar o conteúdo de endotoxinas presentes em uma amostra mediante este ensaio, que oferece somente um resultado qualitativo.

• Existem produtos, como aqueles que contêm plasma sanguíneo, onde as endotoxinas se encontram em uma forma inativa que não produzem febre ao serem inoculadas, porém, com o passar do tempo, devido aos processos metabólicos que o plasma sofre dentro do organismo aparece a toxicidade. Nestas ocasiões, o método de pirogênios em coelhos oferece um resultado falso negativo.

Método LAL

O método LAL tem seu nome devido à hemolinfa do caranguejo ferradura, cujo nome científico é Limulus Polyphemus. A hemolinfa deste caranguejo sofre um processo de coagulação em presença de endotoxina bacteriana, que é o pirogênio que com uma maior probabilidade pode contaminar os reagentes e o material de laboratório. A coagulação da hemolinfa do caranguejo Limulus foi descoberta na década de 60 e com o decorrer dos anos, a mesma equipe de pesquisadores desenvolveu um ensaio para a determinação qualitativa e quantitativa de endotoxinas usando um lisado de amebócitos de caranguejo ferradura. Este ensaio rapidamente começou a se impor como método de determinação de endotoxinas bacterianas, tendo como vantagens um limite baixo de detecção, maior especificidade, um menor custo, uma menor variabilidade dos resultados e a possibilidade de quantificar o conteúdo de endotoxinas. Ainda que este ensaio também faça uso de animais, com suas consequências éticas, a extração da hemolinfa não afeta a vida dos caranguejos.

Por todas as razões discutidas anteriormente, o ensaio de LAL é o método recomendado atualmente pelas principais empresas farmacêuticas e organismos internacionais que regulam o controle de qualidade dos medicamentos e alimentos. Existem casos com a vacina da hepatite B onde se continuou com o uso do ensaio de pirogênios em coelhos para a detecção de endotoxinas, porém se observou que realizando o ensaio de LAL pelo método gel clot e preparando as amostras de vacinas de maneira adequada, é mais conveniente utilizar o método de LAL, inclusive nas amostras onde existem interferências que levam a resultados falsos. Enquanto o ensaio de LAL é específico para endotoxinas e não detecta outras substâncias pirogênicas, em vários medicamentos as endotoxinas são o pirogênio mais comum e o mais nocivo, assim um resultado negativo do ensaio de LAL é suficiente para determinar que a amostra está apta para uso.

Desde que a necessidade de reagentes e kits para fazer o ensaio de LAL começou, diversas empresas em todo o mundo têm trabalhado nesta linha. A marca Pyrostar de Wako se dedica exclusivamente a oferecer aos pesquisadores todos os reagentes, equipes e materiais de laboratório necessários para a determinação de endotoxinas bacterianas mediante o ensaio de lisado de amebócitos de Limulus. Para isso oferece kits para a realização do teste pelos diferentes métodos de detecção que são gelificação, método turbidimétrico e método colorimetria, tanto de maneira qualitativa, como quantitativa.

Bibliografia

1) European Pharmacopoeia 3rd Edition - Supplement 2001. Council of Europe, Strasbourg 2000, pp. 79-87.

2) Trillo, F., Farmacia Galénica, Ed. Madrid, 1ra edición, 1993.

3) Bleeker, W. K., Kannegieter, E. M., Bakker, J. C., Loos, J. A., Prog Clin Biol Res., 189, 293-303, 1985.

4) Young, N. S., Levin, J., Prenderagst, R. A., J. Clin. Invest., 51, 1790-1797, 1972.

5) Richter K, Grahlow WD, Wigert R., Acta Biol Med Ger., 39 (2-3), 277-280, 1980.

6) Park, C. Y., Jung, S. H., Bak, J. P., Lee, SS, Rhee, D. K., Biologicals, 33 (3), 145-51, 2005.

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