Como o teste LAL funciona?

As bactérias gram-negativas podem causar diferentes doenças, incluindo vários tipos de intoxicação alimentar, pneumonia e doenças sexualmente transmissíveis. Essas bactérias contêm moléculas chamadas endotoxinas em suas paredes celulares. Mesmo sem bactérias vivas, as endotoxinas residuais podem ser fatais ao contaminar produtos farmacêuticos ou dispositivos médicos. O contato com as endotoxinas pode desencadear febre ou até sepse.

Para evitar a contaminação por endotoxinas, as empresas usam o teste de lisado de Amebócito Limulus (LAL). O teste LAL é uma maneira simples, econômica e robusta de detectar até mesmo baixos níveis. O ingrediente ativo do teste vem do caranguejo-ferradura (Limulidae). A hemolinfa (um líquido semelhante ao sangue) do caranguejo contém células imunes chamadas amebócitos.

Esses amebócitos são a chave para o teste LAL. Após a exposição às endotoxinas, os amebócitos passam por uma reação química rápida que faz com que as células grudem umas nas outras e forme um coágulo. O caranguejo-ferradura usa esse mecanismo para proteger-se contra o patógeno e impedir que ele se espalhe para o resto do animal.  No entanto, podemos tirar proveito desse processo para detectar endotoxinas em produtos médicos.

Como a cascata de coagulação funciona? É principalmente devido a três zimogênios de serina protease: fator C, fator B e uma enzima coagulante. Os zimogênios (também conhecidos como pró-enzimas) são enzimas inativas na ausência de estímulos, neste caso endotoxinas. Devem ser clivados para serem ativados.

Após a exposição às endotoxinas, o fator C é clivado e, portanto, ativado. O fator C ativado cliva e ativa o fator B, que cliva e ativa a enzima coagulante. Finalmente, esta enzima coagulante ativa cliva uma outra proteína chamada coagulogênio. Um grande número de moléculas de coagulogênio clivadas se combinam para formar um coágulo. A reação é muito eficiente, então o coágulo se forma em apenas 90 segundos.

O teste LAL tira proveito dessa cascata química. Em seu formato original, o teste era qualitativo: os pesquisadores estavam simplesmente procurando formação de gel para determinar a contaminação por endotoxinas. No entanto, as variações modernas do teste aumentaram bastante sua confiabilidade e sensibilidade.

Uma versão quantitativa do teste LAL usa uma leitura cromogênica que depende de uma substância chamada Boc-Leu-Gly-Arg-p-nitroanilida. A sequência de aminoácidos da molécula coincide com a do local clivado no coagulogênio pela enzima de coagulação. Como resultado, ativando a enzima de coagulação, este cliva a substância Boc-Leu-Gly-Arg e libera p-nitroanilida cromogênica. A absorbância da p-nitroanilida livre pode ser detectada a 405 nm.

Outra variante do LAL usa uma leitura turbidimétrica. A turbidez indica a perda de transparência em uma solução aquosa, dependendo da presença de sólidos em suspensão. Quanto mais turvo o líquido, mais sólidos haverá. No caso do teste LAL, os sólidos são coágulos de gel formados durante a reação de coagulação. Ao medi-los com um instrumento como o Toxinometer® ET-7000 da Wako, a quantidade de coagulação pode ser quantificada com precisão e as informações usadas para calcular o teor de endotoxinas.

Conforme descrito, a cascata de coagulação das endotoxinas é uma resposta imune muito eficaz que evoluiu ao longo de milhões de anos. Graças às tecnologias modernas, podemos tirar proveito dessa reação para criar uma detecção de endotoxinas em produtos médicos que podem salvar vidas.

LINHA DE PRODUTOS LAL:

Teste de Limulus PS Wako	Solução extratora de endotoxina	PYROSTAR™ ES-F Plate com CPE