Cinco Dicas Importantes para Reduzir a Contaminação por Endotoxinas no Laboratório

Os sistemas de cultura de células podem ser contaminados por endotoxinas, que são contaminantes químicos produzidos por bactérias gram-negativas e contêm lipopolissacarídeos. A presença de endotoxinas é comum em água, soros e certos aditivos de cultura, particularmente aqueles produzidos por fermentação microbiana. Essas toxinas podem ser medidas com precisão usando o ensaio de Lisado de Amebócitos Limulus (LAL).^[1]

Fontes de endotoxinas

Suprimentos, Meios e Soluções Não estéreis: O uso não intencional de suprimentos, meios ou soluções não estéreis durante procedimentos regulares de cultura de células é uma das principais causas de contaminantes biológicos. Água, meio e reagentes de cultura celular, soro e artigos plásticos são as principais fontes de contaminação por endotoxinas no laboratório.^[1]

Efeito da contaminação por endotoxina

In vivo, essas moléculas com alta reatividade biológica têm efeitos significativos nos sistemas humoral e celular. O uso de sistemas in vitro para estudar endotoxinas revelou seu potencial para influenciar o crescimento e o desempenho de culturas, introduzindo uma fonte notável de variabilidade em experimentos.^[1]

A contaminação com endotoxinas pode causar medições imprecisas da expressão genética ou da função celular nas amostras analisadas. Essa ocorrência foi observada em vários tipos de células e materiais, principalmente por causa dos efeitos pirogênicos das endotoxinas. Um exemplo é quando os nanomateriais são contaminados com endotoxinas, o que pode fazer com que tenham propriedades inflamatórias que interferem na avaliação precisa das suas verdadeiras propriedades biológicas.^[2]

Dicas para Minimizar a Contaminação por Endotoxinas

Despirogenação de Componentes de Vidro

Tradicionalmente, frascos e componentes de vidro são produzidos livres de pirogênios por meio do processo de esterilização por calor seco em temperaturas elevadas. A despirogenação de vidrarias e equipamentos é aconselhável que seja realizada submetendo-os a uma temperatura de 250°C por um período de 45 minutos. Além disso, a destruição de pirogênios pode ser alcançada submetendo-os a temperaturas de 650°C por 1 minuto ou 180°C por 4 horas.^[3]

Despirogenação para Tubos e Artigos Plásticos

Para eliminar pirogênios de tubos plásticos, barras de agitação e outras ferramentas que não são resistentes ao calor, é recomendado lavá-los com Cavicide e depois enxaguá-los completamente com água esterilizada livre de endotoxinas.

Para eliminar eficazmente qualquer resíduo de endotoxina aderido às superfícies internas do instrumento, é vantajoso passar acetonitrila através de um sistema HPLC após o uso de água estéril despirogenada.^[4]

Purificação de Água

Destilação e Osmose Reversa são os dois métodos aprovados de fabricação para sistemas de Água para Injeção. Foi demonstrado que a destilação é uma técnica eficaz e altamente confiável para eliminar endotoxinas de amostras de água contaminada.^[3]

Reagentes e meios livres de endotoxinas

Para mitigar a possibilidade de contaminação por endotoxinas, deve-se utilizar soros, reagentes e meios que tenham sido testados para endotoxinas. Os soros, meios e reagentes desenvolvidos comercialmente foram projetados para evitar a contaminação por endotoxinas e são testados para esse propósito.^[4]

Manter a Esterilidade

É importante evitar a introdução de ar, tosse ou espirros nos tubos ou béqueres de reação. Também é recomendável praticar não tocar no seu rosto. Apesar da natureza aparentemente trivial dessas precauções, elas frequentemente contribuem para a contaminação.^{[3, 5]}

A presença de contaminação por endotoxinas pode levar a resultados experimentais imprecisos e não confiáveis, impactando laboratórios de diagnóstico e de pesquisa. Ao implementar medidas simples, como testes de endotoxinas e utilizar utensílios plásticos apirogênicos, artigos de vidro despirogenados, água de alta pureza e reagentes e meios de cultura celulares testados para endotoxinas, pode-se prevenir efetivamente a contaminação por endotoxinas e garantir a confiabilidade dos resultados obtidos.

Referências

1. Ryan, J.A., Understanding and managing cell culture contamination. 1994: Corning Incorporated.
2. Li, Y. and D. Boraschi, Endotoxin Contamination: A Key Element in the Interpretation of Nanosafety Studies. Nanomedicine, 2016. 11(3): p. 269-287.
3. Dept. of Health, E., and Welfare Public Health Service Food and Drug Administration, Bacterial Endotoxins/Pyrogens. FDA, 2014.
4. (US), N.C.I., Endotoxin & Depyrogenation Tips. National Cancer Institute’s Nanotechnology Characterization Laboratory Assay Cascade Protocols, 2023.
5. Schneier, M., et al., Current technologies to endotoxin detection and removal for biopharmaceutical purification. 2020. 117(8): p. 2588-2609.