As endotoxinas bacterianas como contaminantes de proteínas terapêuticas

A pureza de uma proteína que será utilizada com fins terapêuticos é extremamente importante. Para saber se uma proteína será viável como um medicamento é imprescindível que ela tenha um alto grau de pureza e não provoque reações imunológicas indesejadas nos organismos em que são realizados os testes, antes de sua utilização. As impurezas de uma proteína terapêutica podem ser moléculas similares obtidas como parte da biosíntese da proteína, ou serem provenientes do substrato celular, utilizado em sua produção ou do próprio processo produtivo. É necessário estudar os tipos de contaminantes que estão presentes em qualquer formulação de proteína que será utilizada com fins médicos, e que estes contaminantes podem alterar tanto o perfil de resposta ao principio ativo, como os resultados dos ensaios de toxicidade.

Uma proteína obtida por meio de laboratório, contaminada com endotoxinas bacterianas, provocará febre e outras reações pela proteína em si, ou pelo contaminante. É muito frequente obter resposta imune aos produtos terapêuticos, inclusive aos que têm muita semelhança com as moléculas endógenas, e estas reações afetam a eficácia do medicamento, podendo se considerar que não é um produto seguro, portanto, é necessário realizar um controle específico da presença de lipopolissacarídeos provenientes de bactérias Gram-negativas (endotoxinas bacterianas), tanto no processo de obtenção destas proteínas, como no produto final. Considerando os dados que esses estudos demonstram, as condições em que se produz a proteína são variáveis, sobretudo o processo de purificação para se conseguir a pureza desejada.

DESTAQUE: O impacto das endotoxinas sobre o corpo humano

A contaminação das proteínas terapêuticas por endotoxinas durante o processo de produção pode-se dizer que é frequente, pelo fato de que estes produtos são obtidos, em alguns casos, mediante a modificação genética de bactérias ou outros organismos, que podem estar contaminados pelas mesmas, e que os processos de purificação podem não ser suficientes para eliminar totalmente as células do hospedeiro que sintetizou a proteína ou as estruturas microbianas.

Nem sempre é fácil determinar a quantidade de endotoxinas bacterianas presentes em uma formulação de proteínas terapêuticas. O ensaio de LAL (lisado de amebócitos Limulus) é o método utilizado atualmente, mas tem a desvantagem de que os (1–3)- β-D-glucanos, muitas vezes presentes neste tipo de amostras, podem interferir na medição das endotoxinas. Para isto, a divisão LAL da Wako conta com diferentes kits que possuam o CM-curdlan, que é um derivado carboximetilado de (1–3)- β-D-glucano, que quando se encontra no meio onde se realiza o ensaio de LAL em altas concentrações, elimina a interferência dos compostos desta família.

O kit Limulus PS Single da Wako pode ser utilizado para a determinação de lipopolissacarídeos em formulações de proteínas que serão utilizadas com fins terapêuticos. Este kit é composto pelo reagente ES de LAL, que permite medições pelo método turbidimétrico cinético e uma suspensão de Pyrosep. O Pyrosep é uma resina de afinidade específica para endotoxinas, composta por um suporte insolúvel em água conjugado por um espaçador com histidina, que é a molécula que age como um ligante. Esse kit pode ser usado para determinações em meios hidrofóbicos, com a vantagem de necessitar de uma pequena quantidade de amostra para o ensaio.

Mais: Acessórios LAL para Teste de Endotoxina Bacteriana

Desde os anos 50, no século passado, alguns autores propõem que uma pequena quantidade de endotoxinas, outras espécies que ativem a resposta imune do organismo, pode ser benéfica para que a proteína orgânica tenha mais efetividade em sua ação, já que facilitam a geração de uma resposta imune. Recentemente, vários trabalhos científicos foram publicados em que os mecanismos envolvidos nestes processos são estudados. As endotoxinas agem diretamente sobre os receptores inatos do sistema imune, que ativam a produção de citocinas, espécies reagentes de oxígeno e outras quimiotoxinas, além de aumentar a interação com o antígeno.

Bibliografia:

1) Bonnerjea, J., Methods in Molecular Biology, 244, 455-462, 2004.
2) Johnson AG, Gaines S, Landy M., J Exp Med., 103, 225–246, 1956.
3) Verthelyi D and Wang V., Plos One, 5 (12), e15252, 2010.

LINHA DE PRODUTOS LAL

PYROSTAR™ ES-F (2,0 ml) (sem CPE)	Frasco de Água Reagente para LAL	Toxinometer® ET-6000