A necessidade de testes LAL para a deteção de endotoxinas

Um historial de tragédias esteve na origem da necessidade do ensaio de lisado de amebócitos de Limulus (LAL) para a deteção de endotoxinas na indústria alimentar e médico-farmacêutica da actualidade.

Trata-se de uma história de morbilidades e mortalidades infortunas e do papel da deteção seletiva de endotoxinas estabelecida como uma barreira para prevenir a repetição de tais acontecimentos.

Em 2010 a Baxter, uma empresa bem instituída e líder a nível mundial na indústria farmacêutica, descobriu a presença de endotoxinas bacterianas em vários dos seus produtos. Por sorte, a descoberta desta contaminação deu-se numa era em que a deteção selectiva de endotoxinas bacterianas já era um processo rotineiro realizado previamente ao ingresso e circulação do produto final no mercado. Assim, as medidas preventivas necessárias foram tomadas e evitou-se um feito catastrófico.

Este incidente exemplifica claramente a necessidade e o benefício absoluto dos reagentes LAL para a prevenção de surtos de doença a grande escala por motivo de contaminação de produtos com endotoxinas.

Peanut Corporation of America não foi uma empresa com a mesma sorte. A empresa obteve o record para o retiro massivo de produtos do mercado em toda a história dos Estados Unidos. Em 2008 os produtos de manteiga de amendoim desta empresa foram contaminados com Salmonella, uma bactéria Gram-negativa capaz de produzir endotoxinas. Os produtos contaminados circularam por toda a nação e o seu consumo produziu 200 feridos graves e 9 mortes. Consequentemente, a Peanut Corporation of America foi obrigada a fechar nesse mesmo ano e os seus executivos receberam uma infinidade de processos penais após esta tragédia.

As repercussões de terem sido expedidos produtos contaminados com bactérias e endotoxinas ao público em geral foram avassaladoras. Desconhece-se a quantidade exata de vidas que foram afetadas por morte ou incapacidade. Para qualquer empresa que descuide o adequado controlo de qualidade, um pequeno erro supera bastante qualquer lucro passado, presente ou futuro que possa obter. Um erro apaga qualquer existência ou contribuição da empresa na sociedade.

A maior epidemia de Salmonella da história dos Estados Unidos ocorreu em 1985 a norte do Illinois. A empresa de lacticínios Hillfarm Dairy, a cargo da Jewel Companies, Inc., produzia leite contaminado por antibióticos resistentes à espécie da Salmonella, S. typhimurium. A suposta quantidade de indivíduos afetados superou os 150.000. Assombrosamente confirmaram-se cerca de 16.000 casos através de análises laboratoriais com Salmonella e detetou-se a morte de 9 pessoas. A empresa Hillfarm Dairy foi então obrigada a fechar a sua sede em Melrose Park devido ao descuido.

Outra bactéria que produz endotoxinas e gera epidemias de contaminação alimentar muito populares é a Escherichia coli, E. coli., um habitante natural no intestino do ser humano e de outros mamíferos. Juntamente com a Salmonella, E. coli representa a maior quantidade de casos de envenenamentos bacterianos alimentares.

O pior caso de epidemia por E. coli registou-se em 2011 e ocorreu no norte da Alemanha. As estatísticas revelaram que 3.950 pessoas sofreram patologias e 53 morreram como consequência da epidemia. Investigou-se que a cepa de E. coli responsável por estes incidentes foi o sorotipo O104:H4. Foi uma única raça que produziu as toxinas Shiga que resultaram em sintomas de diarreia com sangue e síndrome urémico hemolítico (SUH). O SUH é um grupo de doenças caracterizadas pela destruição de glóbulos vermelhos, insuficiência renal e diminuição de plaquetas, entre outros sintomas. Várias investigações permitiram às autoridades concluir que a possível fonte de contaminação foram os rebentos de alfafa, provenientes da Baixa Sajonia, Alemanhã, ou importados do Egipto. Uma vez mais, a empresa identificada como a exportadora de alimentos viu-se obrigada a fechar.

As endotoxinas produzidas pela Salmonella e a E. coli, quando introduzidas no corpo humano, estimulam respostas do sistema imunitário e desencadeiam efeitos produzidos pela atividade de várias células de defesa. Estes sistemas celulares de defesa incluem o sistema de cascata de complemento, a cascata de coagulação e a resposta inflamatória. O sistema de cascata de complemento é o responsável pelo reconhecimento da endotoxina, o seu processamento e a sua introdução no sistema imunológico. A resposta inflamatória depois toma medidas para compensar esta presença e eliminar ou conter as endotoxinas. Podem-se gerar vários produtos metabólicos durante estas reações que utilizam todas as vias para reagir simultaneamente. Estas vias são as responsáveis por produzir o mal-estar durante o ciclo da doença. O sistema imunitário pode acabar num estado de fatiga ou a resposta produzida pode ser excessiva e persistir causando maior dano ao organismo. O sistema de coagulação pode gerar coágulos sanguíneos que bloqueiam o fluxo sanguíneo e assim causar insuficiência do funcionamento de algum órgão. O mecanismo de coagulação pode também ver-se afetado e o paciente pode acabar por sofrer uma hemorragia interminável. O sistema inflamatório pode estimular febre, erupções cutâneas de grau ligeiro e um choque anafilático mortal. Os efeitos não controlados da endotoxina no corpo resultam por fim num choque séptico, insuficiência multiorgânica e morte.

As ameaças impostas à humanidade pelos produtos contaminados com endotoxinas são constantes. Por esta principal razão, a Administração de Drogas e Alimentos (FDA) dos Estados Unidos aprovou o uso dos testes de lisado de amebócitos de Limulus (LAL) para detetar a presença de endotoxinas nos produtos manufaturados previamente à sua introdução no mercado. Os ensaios LAL foram aprovados pela FDA há mais de 30 anos e ganharam considerável reputação desde a emissão do aviso do Registo Federal (42 FR 57749) emitido em 1977, que declara que o LAL pode ser utilizado como um “Ensaio para a deteção de endotoxinas em produtos finais” de medicamentos aplicados por via parenteral em seres humanos e animais, mercadorias biológicas e dispositivos médicos. A necessidade óbvia de deteção seletiva de endotoxinas estende o uso do dos sistemas de deteção de LAL aos produtos alimentares e água.

As vantagens oferecidas pelos produtos LAL da PYROSTAR™

Desde que em 1977 se publicaram as normas da FDA sobre os LAL, estas converteram-se na regra de ouro para a deteção de endotoxinas na preparação de produtos comerciais e, em consequência, muitas empresas desenvolveram os seus próprios sistemas de ensaios LAL. O maior obstáculo para selecionar o melhor sistema de deteção de endotoxinas é a variabilidade. A variabilidade define-se como o grau em que um determinado dado difere do standard. Explicitando, significa o grau em que um dado difere de outro. No caso dos ensaios de LAL, é mais adequado descrever a variabilidade como a diferença de resultados entre as diferentes preparações de LAL. São diversos os fatores que contribuem para a dita variabilidade. O LAL consiste numa prova biológica, o reagente em si mesmo é um produto biológico gerado pelo caranguejo ferradura. A endotoxina analisada é um produto biológico de uma bactéria Gram-negativa. Comparativamente às provas químicas, os testes biológicos vêem-se afetados por muitíssimos fatores que podem incrementar a variabilidade.

Quase todas as preparações de reagentes LAL não reagem apenas com as endotoxinas bacterianas mas também na presença de β-1,3 glucano. O β-1,3 glucano é um polissacárido que se encontra naturalmente em bactérias, plantas e fungos. Qualquer β-1,3 glucano presente nas amostras de teste é detetado como um resultado positivo para a presença de endotoxinas, inclusive quando nenhuma está presente. Isto reduz a especificidade do ensaio. Para travar esta reação cruzada, algumas preparações de LAL utilizam soluções tampão; De facto, a presença deste tipo de soluções por si só já contribui para o aumento da variabilidade.

O LAL da PYROSTAR™ utiliza um mecanismo de absorção específica de endotoxinas com filtração dos possíveis reagentes cruzados. Assim permite-se que os ensaios sejam exclusivamente específicos para as endotoxinas e, consequentemente, elimina-se a reatividade cruzada para β-1,3 glucanos. Consequentemente, o LAL da PYROSTAR™ apresenta uma especificidade acrescida para a deteção de endotoxinas. Esta característica evita a necessidade de juntar soluções tampão na solução final e diminuir a variabilidade do LAL da PYROSTAR™.

A deteção de endotoxinas é realizada através de 3 ensaios standard: o ensaio com coágulos de gel, o ensaio turbidimétrico e o ensaio cromogénico. Os 3 métodos estão disponíveis na linha de produtos da PYROSTAR™ como ensaio com coágulos de gel, Ensaio Cinético Turbidimétrico (KTA) e Ensaio Cinético Cromogénico (KCA). Os 3 métodos variam entre si e cada um tem o seu próprio intervalo de deteção com o KCA apresentando a maior sensibilidade de até 0.0002 Eu/mL para o ensaio simples e 0.0005 Eu/mL para ensaios múltiplos. Além disso, conta-se com o sistema do Toxinómetro™ ET-6000 que permite uma leitura automática de estes 3 tipos ensaio. As técnicas são aplicadas adequadamente e sem qualquer esforço.

O ensaio com coágulos de gel é o menos suscetível à inibição, que consiste na presença de alguma substância na amostra do ensaio que poderia diminuir a deteção das endotoxinas e aumentar a probabilidade de um falso negativo. Para evitar esta situação, a Wako desenvolveu o Ensaio Simples de Limulus PS que permite analisar as amostras sem as inibições comuns dos ensaios LAL tradicionais. Inclusivamente, permite que os ensaios se realizem em vitaminas lipossolúveis, azeites e gorduras, desde que solúveis em etanol.

No caso dos investigadores que trabalham com ensaios em microplacas, as “águas termais” são câmaras de ensaio contaminadas que podem originar preparações não esterilizadas ou configurar o ensaio de tal maneira que não permite o manuseio apropriado dos espécimes e materiais. Uma vez mais, a presença de “águas termais” afeta a variabilidade da deteção de endotoxinas. A disponibilidade de ensaios simples da PYROSTAR™ diminui a presença de “águas termais”, reduzindo assim a variabilidade.

Em suma, os produtos LAL da PYROSTAR™ da Wako desenvolveram-se para criar um melhor sistema de deteção de endotoxinas que corrige os problemas atuais com ensaios LAL tradicionais e que é ainda capaz de oferecer vantagens de conveniência, incremento de sensibilidade, especificidade e diminuição da variabilidade.

NOSSOS ACESSÓRIOS LAL

Toxinómetro™ ET-6000	Frasco de Água Reagente para Lisado	Controle Padrão de Endotoxina (CPE)