A importância do uso do glucano nos ensaios de LAL

Através do ensaio de LAL (lisado de amebocitos de Limulus) pode-se determinar a presença de endotoxinas bacterianas em diferentes meios, soluções, material de laboratório, ar, entre outros. Este estudo teve grande importância na indústria e na pesquisa nas últimas décadas, estabelecendo-se como o estudo mais confiável para a detecção de pirogênios. O ensaio de LAL se baseia na cadeia de reações que as endotoxinas bacterianas provocam, provenientes das bactérias Gram-negativas, na hemolinfa do caranguejo Limulus Polyphemus, o caranguejo ferradura, nome comum como é conhecido este caranguejo. A cadeia de reações tem como resultado a coagulação da hemolinfa que é o fenômeno utilizado para a determinação analítica. No entanto, existem outros compostos que também provocam a gelificação no lisado de amebócitos do caranguejo ferradura, provocando interferência no ensaio de endotoxinas bacterianas, alguns destes compostos são (1,3)-β-D-glucanos, que resultam em falsos positivos no ensaio de LAL.

Os (1,3)-β-D-glucanos são compostos polissacarídeos, constituídos por monômeros de glicose, especificamente monômeros de D-glicose unidos através de ligações β-glicosídicas, que são produzidas por muitos organismos procarióticos e eucarióticos. Uma das principais fontes de contaminação de glucanos nos laboratórios vem da celulose do papel, pois estes compostos se encontram na parede celular das células das árvores. Como a operação de filtragem é muito frequente nos laboratórios, e esta é realizada em muitas ocasiões com papel de filtro de celulose, é comum que as amostras estudadas para a detecção de endotoxinas bacterianas contenham (1,3)-β-D-glucanos. As amostras também podem estar contaminadas pelo contato com outros organismos produtores de glucanos.

Os glucanos também são considerados como patógenos nos mamíferos, assim em algumas pesquisas não é um problema que se obtenha um resultado alterado no ensaio de LAL pela presença de glucanos. Os glucanos são considerados moléculas proinflamatórias e com atividade imunológica, e também são capazes de ativar os linfócitos, macrófagos e a cascata de complemento. Porém, na prática, é frequente que o pesquisador precise conhecer a concentração de endotoxinas bacterianas sem a interferência dos glucanos. Isto acontece, principalmente, quando o ensaio de LAL é usado como método de detecção de pirogênios, já que os glucanos em geral são substâncias que não causam febre.

VER TAMBÉM: O impacto das endotoxinas sobre o corpo humano

No ensaio de LAL um resultado positivo é dado pela gelificação que ocorre na dissolução devido à formação da proteína coagulina, que é uma das substâncias obtidas pela cadeia de reações que desencadeia o fator C que existe na hemolinfa do caranguejo, na presença de endotoxinas bacterianas. Quando as substâncias exógenas presentes são (1,3)-β-D-glucanos, o fator G é ativado, mas também dá lugar a que se produza a coagulina, portanto, o resultado é igual se existem endotoxinas bacterianas presentes na solução. Uma alternativa para eliminar a interferência dos glucanos no teste de LAL é remover o fator G do lisado de amebócitos, que é parte reativa, ou inibir a reação que é produzida entre o fator G e o glucano.

Os glucanos contaminantes podem vir de diferentes organismos, por exemplo, a zymosan das leveduras, a laminarina de algas, o lentinano que é utilizado como remédio antitumoral, extraído do cogumelo shitake ou o clurdana, produzido pelas bactérias. Na Wako se utiliza especificamente o curdlana obtido de bactérias para realizar a metilação e obter o clurdana carboximetilado que, adicionado em grandes quantidades ao meio onde se realiza o ensaio de LAL, faz com que os glucanos não interfiram nas medições. Assim, os testes disponíveis na Wako para a determinação de endotoxinas bacterianas mediante o ensaio de LAL das séries Pyrostar ES-F, Limulus Color KY e Limulus PS, contêm na mistura de reagentes liofilizados o curdlana carboximetilado.

Outros reagentes e materiais disponíveis na Wako para a realização do ensaio de lisado de amebócitos de Limulus são:

• Solução extratora de endotoxinas (Solução Extratora de Endotoxina para Teste LAL), que contém albumina de soro humano, substância que faz com que a extração de endotoxinas das amostras seja realizada com maior eficiência do que se for feita apenas com solução salina.

• Tubos para a determinação qualitativa de endotoxinas por formação de gel (Tubos de Reação de Gel Clot).

• Solução de controle padrão de endotoxina (Endotoxina de Controle Padrão), que contém 500 ng de endotoxina purificada e liofilizada da cepa E. Coli UKT-B, usada como padrão nos ensaios de LAL.

• Água para usar nos ensaios de LAL (Água de Reagente de Lisado), que é esterilizada e livre de endotoxinas.

• Ponteiras para micropipetas e tampas de alumínio para os tubos da série BioClean®, que garantem a ausência de endotoxinas e que podem ser usadas com o Toxinômetro.

Existem outros fatores que podem causar interferências no método de LAL, como o pH, uma alta concentração de sais ou a presença de moléculas quelantes como pode ser a heparina, porém, estes temas serão tratados em maior profundidade em outro artigo que publicaremos em breve neste blog.

Bibliografia:

1) James F. Cooper, Marlys E. Weary and Foster T. Jordan, PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology, 51, 1, 2-6, 1997.

2) Wiederhold, N.P., Najvar, L.K., Vallor, A.C., Kirkpatrick, W.R., Bocanegra, R., Molian, D., Olivo, M., Graybill, J.R., and Patterson, T.F., Agents Chemother., 52; 1176-1178, 2008.

3) Pool, J., Joharr, G., James, S., Petersen, I., Bouic, P., Journal of Immunoassay, 20, 79-89, 1997.

4) Roslansky, P. F., Novitsky, T. J., Journal of Clinical Microbiology, Nov., 2477-2483, 1991.

LINHA DE PRODUTOS LAL

Teste de Limulus PS	PYROSTAR™ ES-F/Plate com CPE	Toxinometer® ET-6000