A determinação de endotoxinas bacterianas: Como evitar a contaminação das amostras durante a manipulação?

A manipulação das amostras que vão ser utilizadas no ensaio de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) é a chave para os resultados obtidos. As endotoxinas bacterianas são o contaminante pirogênio mais frequentemente encontrado nas amostras dos medicamentos, alimentos e outros produtos, por isso é muito fácil que as amostras no estudo sejam contaminadas no laboratório por manipulação incorreta e com isso se chegue a conclusões erradas sobre a pureza da amostra em questão. Quando se quer comprovar que um produto está livre de pirogênios se faz os ensaios LAL, que já demonstrou que, apesar do ensaio de pirogênios em coelhos ser sensível a outros pirogênios diferentes às endotoxinas, não são obtidos resultados positivos sem que dê positivo o ensaio de LAL, e pelo contrário, se tem observado que amostras contaminadas por endotoxinas em pequenas quantidades podem negativar o ensaio em coelhos e, mediante o método de LAL, se pode chegar a quantificar a quantidade de endotoxinas presentes. Por essas características apresentadas, o ensaio de LAL foi imposto, tanto na indústria, como nos laboratórios onde se realizam pesquisas como o melhor método para a determinação de pirogênios.

Para se realizar o ensaio de LAL é necessário de um padrão de endotoxinas, que deve se manipular com cuidados extremos. Assim, o primeiro risco a se considerar é sobre a saúde da pessoa que faz o ensaio e aqueles que podem estar compartilhando o ambiente do trabalho. A endotoxina padrão de referência deve ser tratada segundo as instruções que acompanham as embalagens para evitar erros na hora de fazer a curva de calibração.

VER TAMBÉM: A importância de poder contar com a marca PYROSTAR™ em pesquisas com medicamentos

Antes de começar a análise das amostras através de LAL se deve quadriplicar cada uma das soluções com que se forma a curva padrão, e com a análise estatística destas soluções preparadas o funcionário estará qualificado para realizar o ensaio. Um dos pontos a se considerar é que as amostras que serão submetidas ao ensaio de LAL devem ser pasteurizadas ou liofilizadas para sua conservação e nunca congeladas, já que o congelamento provoca perda de endotoxinas que são as responsáveis pela produção da coagulação da hemolinfa do caranguejo Limulus Polyphemus e se obtenha um sinal mensurável proporcional à quantidade de endotoxinas presentes.

Todos os instrumentos que serão utilizados para o ensaio de determinação de endotoxinas devem ser primeiramente despirogenados, onde se podem utilizar alguns dos métodos validados para esta finalidade. O método mais comum para fazer a despirogenação do material de laboratório é o tratamento com ar seco e quente. Como as endotoxinas são resistentes ao calor deve se usar temperaturas maiores de 250º C e comprovar que realmente o material esteja livre de pirogênios. Tem sido reportado que com temperaturas menores e maior tempo de exposição ao calor, os instrumentos também se tornam apirogênicos, por exemplo, a 180º C, aquecendo durante 3 horas. Existem autores que consideram que se pode utilizar a autoclave para a despirogenação ou para a hidrólise ácido-base, pelo fato de que ao se lavar o material com uma solução ácida ou utilizar solução alcalina se provoca a ruptura do complexo lipídico A – proteína que forma a endotoxina. Contudo, ficou comprovado que estes métodos apresentam menos efetividade que o uso do ar seco quente.

Existem outros métodos para a despirogenação de soluções ou de amostras que serão utilizadas em pesquisas com medicamentos ou outros produtos que exijem que o pesquisador se certifique de que se encontram livres de endotoxinas. Alguns destes métodos são: a ultrafiltração, onde ao se passar a amostra por um filtro ultrafino, evita-se a passagem de moléculas grandes como são os lipopolissacarídeos, a cromatografia de intercâmbio iônico, onde se aproveita o fato de que as endotoxinas apresentam uma carga negativa para que fiquem retidas na coluna, porém sua eficácia depende do pH, a velocidade de eluição da coluna e outros fatores que fazem com que o método não seja confiável, a osmose reversa ou a destilação.

Há que se considerar que o material que se compra estéril, muitas vezes deve ser preparado para o teste de LAL, antes de utilizá-lo. Por isso, se recomenda o uso de frascos e demais tubos de ensaio específicos para a determinação de endotoxinas, como são as pipetas e os tubos de reação gel clot que a Wako oferece em seus catálogos, pertencentes à série BioClean®. Não se aconselha reutilizar o material que tenha sido utilizado em um ensaio de LAL para futuros experimentos, assim como o resto do material do laboratório que depois de lavado pode conter resíduos químicos ou biológicos que mascarem as endotoxinas e conduzam a resultados falsos do teste de LAL.

No ensaio de LAL se deve tomar outras precauções como deixar secar os frascos pelo menos durante uma noite se a endotoxina se aplica diretamente no fundo dos mesmos, para medir a curva padrão e realizar este procedimento sob uma cabine com corrente de ar unidirecional. Fazer o ensaio de LAL em todos os produtos de início, assim com a água e as vidrarias de laboratório é importante nos casos em que se observa contaminação de amostras por endotoxinas no produto final. Além disso, cada vez que se compre o reagente de LAL deve-se comprovar sua sensibilidade com o padrão de endotoxina requerida e com isso estarmos seguros de que as medidas estão sendo realizadas corretamente.

Por tudo o que foi comentado, recomenda-se aos pesquisadores e técnicos encarregados de realizarem este ensaio que trabalhem com reagentes de qualidade e cujo uso não precise de material adicional de laboratório. Estas características são cumpridas pelos kits que a Divisão LAL comercializa, que funcionam através dos três métodos de detecção empregados no ensaio de LAL, colorimétrico, turbodimétrico e de gelificação.

Bibliografia

1) Novitsky, T. J., Oceanus, 27(1), 13-18, 1991.

2) Tsuji, K. et al., App. and Env. Microbial, 36, 705-719, 1978.

3) Sandle, T., American Pharm. Reviews, epub 28 octubre, 2013.

LINHA DE PRODUTOS LAL

Controle Padrão de Endotoxina (CPE)	Solución extractora de endotoxina para ensayos del LAL	PYROSTAR™ ES-F / Plate com CPE