Uso del Método Turbidimétrico en el Ensayo LAL
El método turbidimétrico, es uno de los métodos utilizados para la detección del punto final cuando se realiza el análisis de endotoxinas usando el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (LAL). Aplicando el método turbidimétrico se puede realizar el ensayo LAL de manera semi-cuantitativa o cuantitativa.
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El test de LAL mide la turbidez formada en una disolución por la reacción de coagulación que ocurre cuando los amebocitos extraídos del cangrejo Limulus Polyphemus entran en contacto con endotoxinas bacterianas. Las endotoxinas provocan el comienzo de una cascada de reacciones que provocan la precipitación de proteínas en forma de gel. Las endotoxinas bacterianas son patógenos muy peligrosos, por lo que es importante realizar este test a todos los productos farmacéuticos, alimenticios o de cualquier otro tipo que vayan a estar en contacto con humanos o animales y puedan provocar la intoxicación por endotoxinas. Las bacterias Gram negativas son las que liberan las endotoxinas al romperse su pared celular cuando son atacadas por los mecanismos de defensa de los humanos y animales. Los altos niveles de citocinas en sangre que trae como consecuencia la activación de los sistemas de defensa puede causar afecciones respiratorias severas, procesos inflamatorios y sepsis generalizada.
La turbidimetría es un tipo de medición óptica basada en la medición de la pérdida de transparencia que tienen las disoluciones al aparecer partículas suspendidas. Esta técnica analítica permite medir la concentración del analito responsable de la turbidez por la pérdida de la transmisión de la luz que atraviesa la disolución. Al aumentar la concentración del analito mayor cantidad de radiación es dispersada y/o absorbida, por lo que disminuye la intensidad de luz medida por el detector. El equipo usado para medir la luz que atraviesa la muestra en estos análisis es un espectrofotómetro, o los turbidímetros que son espectrofotómetros especializados en medir turbidez. Ambos equipos son relativamente económicos y al tener aplicación en gran variedad de ensayos están disponibles en la mayoría de los laboratorios de investigación. Por ejemplo, en los laboratorios de microbiología se usan los métodos turbidimétricos para controlar el crecimiento de una población de células.
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Al aplicar la turbidimetría al ensayo de LAL se pueden realizar medidas cuantitativas de la cantidad de endotoxinas presente en un medio, que es proporcional a la turbidez generada. El análisis de LAL, usando turbidimetría, puede tener como método de detección el método turbidimétrico de punto final o del método turbidimétrico cinético. En el ensayo turbidimétrico de punto final se realiza la lectura de la turbidez a un tiempo determinado después de entrar en contacto el reactivo que contiene el lisado con la muestra. Como principal desventaja del método se pueden mencionar los errores de manipulación que son bastante frecuentes y afectan los resultados y la necesidad de repetir todo el proceso desde el inicio si se comete algún error que afecte la lectura ya que hay un único momento para hacer la medición y debe ser preciso. De no leerse la turbidez en el momento indicado la gelificación continúa y conlleva a errores al calcular las concentraciones de endotoxinas, de aquí que el método del punto final no se use con frecuencia.
El método turbidimétrico cinético, por su parte, es el elegido en la mayor parte de los casos en que se necesita hacer el ensayo de LAL de manera cuantitativa. Las ventajas más importantes de este método es la posibilidad de usar lectores de placas acoplados a ordenadores que posibilitan la lectura automatizada; un error que induzca a un punto de lectura erróneo no provoca que haya que realizar todo el análisis, este punto puede ser desechado a la hora de hacer los cálculos; se puede lograr un bajo límite de detección y detectar endotoxinas en un amplio rango de concentraciones. Para construir las curvas de calibración y las curvas de medida del ensayo de LAL usando este método se usan los valores de los antilogaritmos de la variable tiempo y los antilogaritmos de la concentración y se consiguen líneas rectas en todo el rango de aplicación de la Ley de Lambert Beer. Para obtener una buena reproducibilidad y exactitud en los resultados es necesario controlar la temperatura del ensayo y trabajar a la temperatura indicada por el fabricante de los reactivos.
