Uso del Método Gel-Clot en el ensayo de LAL

El ensayo de LAL (lisado de amebocitos de Limulus) se utiliza para determinar la presencia de endotoxinas bacterianas en muestras biológicas o de otros tipos, este análisis se puede llevar a cabo usando para la detección el método Gel-Clot o gelificación, ya que, si la prueba es positiva, se forma un gel.

Las bacterias pueden provocar toxicidad debido a sustancias exógenas, que son las llamadas exotoxinas, y a sustancias endógenas, las endotoxinas. Se conoce como endotoxinas bacterianas a los lipopolisacáridos que forman parte de la pared celular de las bacterias Gram negativas y que al romperse la membrana son liberados al medio, provocando una alta toxicidad en mamíferos y otros animales. La causante de la toxicidad de los lipopolisacàridos es la fracción lipídica de estas moléculas, cuya estructura puede variar en los diferentes tipos de bacterias. Al pasar la fracción lipídica al torrente sanguíneo de los animales y el hombre, entre las reacciones que pueden ocurrir está la activación de la secreción de interleucinas y de factor de necrosis tumoral, provocando reacciones inflamatorias que pueden ocasionar desde infecciones leves hasta la muerte del individuo.

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En el caso del cangrejo Limulus polyphemus, la contaminación con endotoxinas produce una serie de reacciones que dan lugar a la coagulación en su hemolinfa. En estas reacciones se basa el principio del ensayo LAL, siendo los amebocitos las entidades que se aislan de la hemolinfa para usarse en el ensayo pues es donde ocurre este proceso. Los amebocitos, en los invertebrados, son equivalentes a los glóbulos blancos en los vertebrados, teniendo una función protectora frente a patógenos que pueden dañar al animal. Los amebocitos contienen enzimas que desencadenan una cascada de reacciones cuyo producto final es un gel compuesto por proteínas coaguladas. El ensayo de LAL se ha convertido en el ensayo de referencia para la detección de pirógenos en la industria, debido a que las endotoxinas bacterianas son los pirógenos más abundantes.

El ensayo de LAL puede realizarse usando diferentes métodos que indican que está ocurriendo el proceso de gelificación en el medio de reacción por la presencia de las endotoxinas. Estos métodos pueden ser Gel-Clot, turbidimétricos y cromogénicos. El método Gel-Clot consiste en determinar si aparece un gel en el lisado: el proceso de gelificación se debe a la coagulación de las proteínas que provocan las endotoxinas. Este método es el más utilizado para el ensayo LAL, siendo el método de elección recomendado por la FDA, a menos que se indique lo contrario por el tipo de muestra en estudio. Se puede realizar el ensayo, por el método Gel-Clot, de manera cualitativa, siendo la aparición del gel el resultado positivo del test, o de manera semicuantitativa, ya que la cantidad de gel que se forma es proporcional a la concentración de endotoxinas.

Uno de los principales interferentes de este ensayo son los β (1→3) - D -glucanos, que también son capaces de activar la cascada de reacciones que conduce a la formación del gel, mediante vía de activación del Factor G. En el mercado existen diversos kits donde se extrae el Factor G del lisado de amebocitos para evitar esta interferencia. Otra posibilidad que existe para eliminar la activación por parte de β (1→3) -D-glucanos, es inhibir la acción del factor G. En los kits para el análisis de LAL de la marca PYROSTAR esto se consigue adicionando Curdam, un derivado de β (1→3) - D -glucano que en altas concentraciones inactiva el factor G y por lo tanto no se desencadenan las reacciones que conducen a la formación de la coagulina.

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