Detección de endotoxinas mediante el ensayo de LAL, método cromogénico

La detección de endotoxinas por LAL (lisado de amebocitos de Limulus) es una técnica que se usa a diario en los laboratorios de investigación, sobre todo en los laboratorios donde se investigan temas biológicos y más específicamente en los de biomedicina. Esta técnica además está ampliamente difundida en la industria farmaceútica, donde se usa para comprobar que los medicamentos no contengan endotoxinas en su formulación final y está aprobada por la mayoría de las farmacopeas como prueba estándar de control de pirógenos. También se usa para otro tipo de medios susceptibles a estar contaminados con endotoxinas bacterianas, por ejemplo es de gran utilidad en el control de calidad de alimentos o de aguas. Ya discutimos en artículo anteriores los métodos de gelificación y turbidimétricos usados en la técnica de LAL, en el presente artículo nos enfocaremos en el método cromogénico como forma de cuantificar las endotoxinas bacterianas presentes en un medio.

Métodos cromogénicos de análisis

Se conoce como métodos cromogénicos a los métodos de análisis óptico que permiten medir la presencia de un analito (análisis cualitativo) y su concentración en diferentes medios (análisis cuantitativo), mediante cambios de color. La mayoría de los compuestos químicos son capaces de interaccionar con la luz dando como resultado una señal analítica fácilmente medible. Los métodos ópticos de análisis se dividen según si los cambios se producen en el espectro electromagnético, que serían los métodos espectroscópicos o en la dirección de propagación de la luz, métodos no espectroscópicos,

Los métodos ópticos espectroscópicos agrupan tanto a aquellos procesos basados en la absorción de luz, donde estarían los llamados métodos colorimétricos o cromogénicos, como a los relacionados con la emisión de luz, fluorescencia, emisión de rayos X y fosforescencia, por ejemplo. Para estudiar los procesos de absorción de luz se utiliza un espectrofotómetro, donde puede medirse tanto la luz transmitida como la absorbida, según sea más conveniente para el usuario. Es más común realizar las medidas de la absorbancia, que según establece la Ley de Lambert Beer es proporcional a la concentración de la especies o especies absorbentes que se encuentren en la disolución.

La radiación electromagnética visible, es aquella cuya longitud de onda se encuentra entre los 380 nm y los 770 nm. Los métodos cromogénicos de análisis se basan en el uso de sustancias que absorben luz en esta franja del espectro electromagnético y que conocemos como colorantes. Existen muchos compuestos que tienen su máximo de absorción en la región visible, que comprende del violeta al rojo. La banda absorción de un colorante cambia de intensidad proporcionalmente a la concentración de esta sustancia en el medio.

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Ensayo de lisado de amebocitos de Limulus usando métodos cromogénicos de detección de endotoxinas

El método de detección de endotoxinas bacterianas usando el lisado de amebocitos de Limulus (LAL) se desarrolló en la década del 60 del siglo pasado y desde ese momento ha sido una herramienta muy útil en investigación y en la industria. Ya desde principios de siglo se conocía que la hemolinfa del cangrejo Limulus Polyphemus sufría un proceso de coagulación. Más tarde se pudo conocer que la coagulación de la hemolinfa era causada por las bacterias Gram negativas, que provocan que se desencadenen una serie de reacciones enzimáticas en cascada. Estas reacciones enzimáticas ocurren en los amebocitos, debido a la presencia de las endotoxinas que constituyen la pared celular de las bacterias Gram negativas, y dan como resultado la formación de coagulina, proteína causante del proceso de coagulación.

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Posteriormente las investigaciones sobre la cascada de reacciones enzimáticas que se produce en los amebocitos de Limulus arrojaron que estas reacciones son capaces de romper enlaces de péptidos que se encuentran unidos a moléculas de p-nitroanilina. Al liberarse la p-nitroanilina, que es un colorante amarillo, se colorea la disolución. Añadiendo un péptido unido a p-nitroanilina al lisado de amebocitos de Limulus, reactivo del ensayo de LAL, cuando hay endotoxinas en el medio se desarrolla color en la disolución, por lo que se puede llevar a cabo a detección de las endotoxinas por un método cromogénico. En este caso se necesita un espectrofotómetro para cuantificar la concentración de colorante liberado producto de la reacción enzimática. Este método de detección puede parecer caro por el hecho de necesitar un espectrofotómetro, pero no es así si se tiene en cuenta que en cualquier laboratorio el espectrofotómetro tiene un uso variado, no se necesitaría un equipo especial para este ensayo.

Para llevar a cabo la detección de endotoxinas bacterianas por el método cromogénico en el ensayo de LAL, existen 2 variantes: el método cromogénico de punto final y el método cromogénico cinético. El método cromogénico cinético se basa en la medida del color a diferentes intervalos de tiempo después de añadido el reactivo de LAL que contiene el reactivo cromogénico, a la disolución que puede contener endotoxinas. Las ventajas de este método son diversas: puede ser totalmente automatizado, permite la medición de muchas muestras en un corto período de tiempo y los resultados se procesan fácilmente. La desventaja principal es que muchas sustancias pueden causar interferencia, aquellas que absorven alrededor de 400 nm que es la zona donde se encuentra la banda de absorción de la p-nitroanilina, las que forman quelatos o desnaturalizan las proteínas, etc. Además hay que evitar que la disolución esté turbia, para realizar la medida sin los errores que puede producir la turbidez en el dato de absorbancia que se obtiene.

El método cromogénico de punto final, como su nombre indica, mide la aparición de color una vez terminada la reacción enzimática. Según el fabricante del kit del ensayo de LAL, la reacción enzimática se considera terminada al finalizar el período de incubación o después de acidificar la disolución. Usando cualquiera de estas dos opciones este método presenta una desventaja con respecto al cinético, y es que se realiza una única medida por cada disolución de muestra, al igual que en el método turbidimétrico de punto final si la medida es errónea por cualquier motivo hay que repetir el ensayo. Sin embargo en el método cromogénico cinético se recogen varias medidas de absorbancia, a diferentes tiempos, por lo que un error en una medida no conlleva a que se tenga que realizar nuevamente todo el ensayo, se puede obtener un resultado fiable desechando un punto de la curva. Pero el método cromogénico de punto final tiene la ventaja de que en muestras en las que puedan existir interferencias en la zona donde absorbe la p-nitroanilina se pueden formar derivados de esta sustancia y así obtener otro colorante en una zona donde la medida sea más reproducible. Por ejemplo, existen test de LAL que usan la formación de un azo compuesto de la p-nitroanilina para realizar la medida por encima de los 500 nm, zona en la que suelen haber menos interferencias y además la formación del azo compuesto permite disminuir el límite de detección del ensayo, pues los azo compuestos tienen bandas con un mayor coeficiente de extinción que la p-nitroanilina.

También se puede usar el método cromogénico de punto final para el análisis cualitativo de endotoxinas mediante el ensayo de LAL. La aparición de color se observa a simple vista, requiriendo un tiempo menor de incubación que el método de gelificación, que es el que comúnmente se usa para análisis cualitativos de endotoxinas. Además evita los posibles errores que pueden cometerse con el ensayo mediante el método de gilificación por ruptura del gel antes o durante la medida.

Test Limulus Color KY para la detección de endotoxinas

El Test Limulus Color KY comercializado por Wako está diseñado para determinar de manera cuantitativa la cantidad de endotoxina bacteriana presente en una muestra. Al reaccionar la endotoxina con el lisado de amebocitos de Limulus se libera un cromóforo que es el responsable de colorear la muestra y que permite la detección colorimétrica. La cantidad de endotoxina presente es proporcional a la cantidad de cromóforo liberado y por tanto a la intensidad de la banda de absorción responsable del color.

Este test ha sido utilizado en diversos trabajos de investigación desde que salió a la venta. Como ejemplo podemos mencionar las siguientes investigaciones.

• En estudios sobre la inactivación de la neumolisina, toxina proveniente del Streptococcus pneumoniae y causante de afecciones como la neumonía y la meningitis. H. Baba y colaboradores en el trabajo titulado “Induction of Gamma Interferon and Nitric Oxide by Truncated Pneumolysin That Lacks Pore-Forming Activity” usaron el test Limulus Color KY para comprobar que la neumolisina recombinante sintetizada por ellos estaba libre de endotoxinas. (Infect Immun. Jan 2002; 70 (1), 107–113.)

• En el caso de Nakano T. y colaboradores usaron el Test Limulus Color KY de Wako para comprobar que los anticuerpos usados en sus estudios del papel de los neutrófilos en los mecanismos de defensa del sistema inmune, no estaban contaminados con endotoxinas. (Activation of neutrophils by a novel triggering immunoglobulin-like receptor MAIR-IV, Mol Immunol. 2008 Jan; 45 (1), 289-94.)

• C. Kohda y colaboradores también hicieron uso del Test Limulus Color KY para comprobar que diferentes fragmentos de listeriolisina O sintetizados por ellos estuviesen libres de endotoxinas. En este caso a pesar de que la listeriolisina O proviene de la bacteria Listeria monocytogenes, que es Gram positiva, para estudiar sus efectos tóxicos en el organismo era necesario asegurarse que las moléculas utilizadas en los ensayos no contenían endotoxinas. (Dissociated Linkage of Cytokine-Inducing Activity and Cytotoxicity to Different Domains of Listeriolysin O from Listeria monocytogenes, Infect. Immun. 2002, 70 (3), 1334.)

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