Uso del Método Colorimétrico en el Ensayo de LAL

Los métodos colorimétricos de análisis permiten, mediante la medida de la variación de absorbancia de una muestra a determinada longitud de onda, calcular la concentración de los analitos de interés. Este método de detección puede ser usado en el ensayo LAL (lisado de amebocitos de Limulus) para endotoxinas.

Descubra y cotice en línea nuestros Reactivos LAL Específicos para Endotoxinas AQUÍ

El ensayo de LAL es una técnica muy conocida por los investigadores para la determinación de endotoxinas procedentes de la membrana celular de las bacterias Gram negativas. Este ensayo fue desarrollado en la década de 1960, cuando se aprovechó el hecho de que la hemolinfa del cangrejo Limulus Polyphemus sufría un proceso de coagulación en presencia de las endotoxinas para convertirlo en una técnica analítica.

 La cascada de reacciones enzimáticas que ocurre en los amebocitos de Limulus en presencia de endotoxinas bacterianas, dan lugar a la formación de coagulina, que provoca la aparición de turbidez en el medio de reacción. Estas mismas reacciones rompen los enlaces peptídicos que unen a la p-nitroanilina con una proteína, de aquí que este colorante pueda utilizarse como señal de que están ocurriendo las reacciones de defensa en el lisado de amebocitos. La p-nitroanilina libre es de color amarillo y permite usar un método cromogénico para la detección de las endotoxinas. Con el uso de un espectrofotómetro se cuantifica la concentración de colorante liberado al producirse las reacciones enzimáticas inducidas por la endotoxina.

También le puede interesar: Uso del Método Turbidimétrico en el ensayo LAL

Los métodos de análisis óptico son sencillos y baratos, por lo que, dependiendo de las características de la muestra, son el método de elección para la cuantificación de endotoxinas. Para aplicar el método cromogénico en el ensayo de LAL de detección de endotoxinas bacterianas se puede realizar el análisis por el método cromogénico de punto final o por el método cromogénico cinético.

El método cromogénico cinético se basa en la medida del color de la muestra de ensayo a diferentes intervalos de tiempo después de añadido el reactivo de LAL que contiene la sustancia colorida. Como ventaja de este método tenemos el que se puede automatizar, ahorrando tiempo y permitiendo realizar mayor número de medidas. Tiene como desventaja que no puede ser aplicado cuando hay otras moléculas con color que pueden causar interferencias. La banda de absorción de la p-nitroanilina se encuentra alrededor de los 400 nm, zona donde también absorben gran cantidad de grupos cromóforos.

El método cromogénico de punto final por su parte, se basa en la medida de la absorbancia de la muestra una vez terminada la reacción, que según el kit de ensayo puede ser al finalizar el período de incubación o una vez acidificada la disolución. Aunque el método es cromogénico y ofrece las mismas ventajas que el cinético, tiene la clara desventaja de que el resultado se toma solo a partir de una medida y no de varias como en el cinético. Si la medida tomada tiene error, no hay manera de comprobarlo incluso haciendo réplicas del ensayo (lo que conduce a un mayor gasto de reactivos); por lo que hay mayor probabilidad de obtener resultados falsos. Debido a esta desventaja, el método cromogénico de punto final solo es usado para realizar ensayos cualitativos o cuando, por razones de interferencias, es necesario formar un derivado de la p-nitroanilina liberada una vez terminada la reacción. De esta manera es posible realizar medidas en muestras que contienen colorantes que interfieren en la zona de absorción de la p-nitroanilina.