Transición del Coágulo de Gel a la Prueba Cinética
La importancia de las pruebas de endotoxinas
Las endotoxinas están omnipresentes en el medio ambiente y se liberan principalmente de la membrana externa de las bacterias gramnegativas durante la lisis bacteriana. Si las endotoxinas bacterianas acceden por vía parenteral al organismo humano, pueden causar inflamación, shock séptico, hemorragia e incluso la muerte.1 Además, en aplicaciones de investigación, la contaminación por endotoxinas conduce a resultados poco fiables y posiblemente a interpretaciones engañosas. Por lo tanto, las pruebas de endotoxinas se han convertido en una parte integral del desarrollo y control de calidad de productos farmacéuticos inyectables y dispositivos médicos.
El ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) como la mejor de las pruebas de endotoxinas establecidas
Se han desarrollado varios métodos para la prueba de endotoxinas. Entre ellos, el ensayo LAL se ha establecido como la prueba estándar de oro para la determinación de endotoxinas.2,3 El ensayo LAL se basa en la incubación de proteínas extraídas de la sangre de cangrejos herradura con una muestra analizada para determinar el contenido de endotoxinas. Si la muestra investigada contiene endotoxina, las enzimas que favorecen la coagulación en el LAL interactúan con ella, lo que provoca la activación de la cascada de coagulación, la modificación del coagulógeno de los amebocitos y la formación de un coágulo de gel. Esto se conoce como método o técnica de coágulo de gel (Gel-clot). El coágulo de gel formado se visualiza y se evalúa cualitativamente. Aunque la técnica del coágulo de gel es sensible y fácil de usar, no permite ni una cuantificación de endotoxinas ni un análisis de alto rendimiento. Por lo tanto, también se han desarrollado ensayos LAL cuantitativos.
El desarrollo y las ventajas de los ensayos cinéticos de LAL
Los ensayos LAL cinéticos tienen ventajas significativas, porque pueden cuantificar el contenido de endotoxinas en una amplia gama de concentraciones y permiten el análisis automatizado, lo que reduce las variaciones del ensayo relacionadas con el usuario. La cuantificación de endotoxinas se puede realizar evaluando la turbidez (un ensayo LAL turbidimétrico) o los cambios de color de la mezcla de reacción (un ensayo LAL cromogénico). Los ensayos LALturbidimétricos y cromogénicos se pueden utilizar como ensayos cinéticos y de punto final.
Ensayo LAL turbidimétrico cuantitativo
El ensayo LAL turbidimétrico cuantitativo evalúa la formación de turbidez que se produce después de la escisión del sustrato enzimático y antes de la formación de gel. La turbidez se cuantifica utilizando un espectrofotómetro o un lector de microplacas. El ensayo LAL turbidimétrico cuantitativo es fiable, sensible y compatible con un análisis de alto rendimiento.
Ensayo LAL cromogénico cuantitativo
El ensayo LAL cromogénico se basa en la escisión de un sustrato cromogénico, lo que conduce a la liberación de cromógeno. A continuación, la reacción colorimétrica se visualiza y cuantifica fotométricamente. El ensayo LAL cromogénico cuantitativo es muy sensible y permite mediciones de endotoxinas automatizadas y análisis de alto rendimiento.
Ensayos cuantitativos basados en el factor C recombinante
También se han desarrollado ensayos basados en el factor C recombinante para la determinación cuantitativa de endotoxinas. Emplean el factor C recombinante, que es el componente inicial de la cascada de coagulación del cangrejo herradura, inducida por endotoxinas.4
Consideraciones para la transición a la prueba cinética de LAL
El ensayo LAL ha sido ampliamente aceptado como prueba estándar para la determinación de endotoxinas.2,3 Aunque todas las variaciones del ensayo LAL son sensibles y confiables, los ensayos LAL cuantitativos y los ensayos basados en el factor C recombinante están ganando popularidad debido a su capacidad para proporcionar determinación cuantitativa y de alto rendimiento de endotoxinas. Se debe considerar una serie de factores al seleccionar el ensayo cuantitativo más apropiado para la determinación de endotoxinas,5 entre ellos la naturaleza y las características de las muestras analizadas, el equipo disponible y los posibles requisitos reglamentarios pertinentes.
Bibliografía
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