Superando la interferencia de muestra en el ensayo del LAL
¿Qué es la interferencia de muestra?
La interferencia de muestra ocurre cuando una sustancia o un proceso desarrollado en una muestra produce resultados de prueba que son incorrectos. Las consecuencias potenciales de una interferencia de muestra son graves, incluso llevando a una interpretación engañosa o un diagnóstico incorrecto. La interferencia de muestra puede ser tanto endógena como exógena. La interferencia endógena ocurre debido a sustancias que se encuentran naturalmente en la muestra. La interferencia exógena ocurre debido a sustancias o procesos externos, como drogas, aditivos, componentes del tubo de recolección, pasos de procesamiento, la formación de coágulos o contaminación.1 Debido a las consecuencias negativas y potencialmente severas de la interferencia de muestra, siempre se debe considerar este riesgo al diseñar y llevar a cabo las pruebas.
El ensayo del lisado de amebocito limulus (LAL)
El ensayo del lisado de amebocito limulus (LAL) se emplea para detectar la presencia de endotoxinas bacterianas en muestras analizadas. Las endotoxinas son liberadas de la membrana exterior de bacterias gramnegativas principalmente luego de la lisis celular bacteriana. Si las endotoxinas logran un acceso parenteral al cuerpo humano, pueden llevar a inflamación, fiebre, shock e incluso a la muerte.2 El ensayo del LAL se basa en la incubación de proteína extraída de la sangre del cangrejo cacerola con una muestra analizada. Si se encuentra endotoxina en la muestra, se desarrolla una reacción de coagulación.3 El coágulo se puede visualizar de manera cualitativa, lo que se designa como un ensayo de coágulo de gel. La cuantificación de la endotoxina se puede realizar al medir la turbidez (un ensayo turbidimétrico del LAL) o a través de la determinación colorimétrica en una modificación de la técnica de coágulo de gel (un ensayo cromogénico del LAL).
Interferencia de muestra en el ensayo del LAL y factores que interfieren
En un estudio inicial, se evaluó la posibilidad de interferencia en el ensayo del LAL para 333 productos farmacéuticos. Si las muestras no eran diluidas o tratadas de ninguna manera, 236 (71%) de estos productos farmacéuticos interferían con la prueba.4 Una variedad de factores podrían producir un riesgo de interferencia de muestra en el ensayo del LAL, ya sea al activar la misma cadena de reacciones enzimáticas que el reactivo del LAL, o al activar otra vía que llevaría a la coagulación y a la turbidez. Los factores de interferencia pueden incluir la resistencia iónica y el pH de la mezcla de reacción, sustancias orgánicas con propiedades quelantes o anticoagulantes, oxidantes u otros compuestos con propiedades de desnaturalización de las enzimas, factores de interferencia que imitan la acción de las endotoxinas (como (1→3)-ß-D-glucanos, proteasas de serina y filtros de celulosa) o nanomateriales.5,6 Por otra parte, los compuestos coloreados pueden interferir con el ensayo cromogénico del LAL.5 Existen varias estrategias para evitar la interferencia de muestra del ensayo del LAL. Cabe destacar, si los tratamientos de la mezcla del reactivo se utilizan para reducir la interferencia de muestra, los ensayos modificados deben ser validados por su capacidad de detectar endotoxinas.5
Estrategias para la reducción de la interferencia de muestra del ensayo del LAL5,6
Dilución de la muestra
El diluir las muestras hasta cierto grado, al que el factor interferente ya no afecta los resultados de prueba, pero al que la endotoxina sigue siendo detectable, es la estrategia más ampliamente aplicada para superar la interferencia de muestra del ensayo del LAL. La dilución más alta a la que se puede detectar la endotoxina se conoce como la máxima dilución válida (MDV). En muchos casos, la dilución de muestra es suficiente para superar la interferencia y es la que siempre se debe intentar primero.
Mantener un rango óptimo de pH
El pH de la mezcla de reacción debe mantenerse dentro de un rango óptimo; comúnmente entre 6.0-8.0. No obstante, siempre se debe observar el rango específico de pH para cada kit del ensayo del LAL. Se puede obtener el rango óptimo de pH a través de la capacidad de amortiguación de la mezcla de reactivo. Si estas medidas no son satisfactorias, ciertos amortiguadores específicos que promueven el rango de pH óptimo se pueden emplear para reconstituir el reactivo o la muestra del LAL.
Corregir las concentraciones excesivas de los cationes divalentes
Los cationes divalentes como Ca2+ y Mg2+ también pueden alterar la reacción del LAL. Las concentraciones excesivas de estos cationes pueden neutralizar la carga negativa de endotoxinas, promover los agregados de endotoxina, reducir la actividad de endotoxina y llevar a la inhibición de la reacción. La dilución generalmente se emplea para reducir la concentración del catión. Si esto no es suficiente, se puede aplicar la ultrafiltración para separar la endotoxina y las sustancias interferentes.
La importancia de prevenir interferencias de muestra en el ensayo del LAL
El ensayo del LAL es la prueba más comúnmente utilizada para la detección de endotoxinas. No obstante, existen los riesgos de interferencia de muestra y pueden tener consecuencias perjudiciales. La dilución de muestra es generalmente la primera estrategia aplicada para superar la interferencia de muestra y en muchos casos, es suficiente. Si este enfoque no es exitoso, se pueden emplear los métodos de optimizar el rango de pH y la resistencia iónica, o remover los compuestos interferentes. Sin embargo, si se realiza un tratamiento a la mezcla de reacción para superar la interferencia de muestra, el ensayo modificado debe ser validado por su capacidad de detectar endotoxinas.
Fuentes de literatura
- Dimeski G. Interference testing. The Clinical Biochemist Reviews 2008; 29 (Suppl 1): S43–S48.
- Sampath VP. Bacterial endotoxin-lipopolysaccharide; structure, function and its role in immunity in vertebrates and invertebrates. Agriculture and Natural Resources 2018; 52 (2): 115–120.
- Novitsky TJ. Biomedical applications of Limulus Amebocyte lysate. J.T. Tanacredi et al. (eds.), Biology and Conservation of Horseshoe Crabs, DOI 10.1007/978-0-387-89959-6_20, Springer Science+Business Media, LLC 2009.
- Twohy CW, Duran AP, Munson TE. Endotoxin contamination of parenteral drugs and radiopharmaceuticals as determined by the Limulus amebocyte lysate method. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology 1984; 38: 190–201.
- Dawson ME. Interference with the LAL test and how to address it. LAL Update 2005; 22(3): 1–5.
- Interfering factors in the LAL test. Fujifilm. https://www.wakopyrostar.com/blog/kit-lal/post/interfering-factors-in-the-lal-test/
