Reactivos y Accesorios para el Test del Lisado de Amebocitos de Limulus (LAL)

El Test o Prueba del Lisado de Amebocito de Limulus (LAL) es un método para la detección y cuantificación de endotoxinas bacterianas ampliamente utilizado por la industria farmacéutica y biotecnológica. Su principio bioquímico se basa en la reacción de coagulación de la hemolinfa de Limulus polyphemus o Cangrejo Herradura del Atlántico, como se le conoce vulgarmente, en presencia de antígenos de superficie microbiana como los Lipopolisacáridos o endotoxinas bacterianas.

La empresa Wako Chemicals destaca entre las compañías fabricantes de reactivos LAL a nivel internacional por su formulación única de un reactivo LAL específico a endotoxina bacteriana sin la interferencia de beta glucanos, en las muestras, gracias a la adición de Curdlan carboximetilado (CMC) coliofilizado con el LAL. Bajo la marca PYROSTAR™, esta empresa distribuidora de reactivos para la investigación, fabrica y comercializa reactivos y accesorios LAL que cumplen con todas las normas, las regulaciones y los estándares de calidad establecidos por la FDA de Estados Unidos.

A continuación vamos a comentar sobre los distintos reactivos y accesorios con los que Wako contribuye al estudio de las endotoxinas bacterianas:

En primer lugar tenemos el kit de Ensayo Simple de Limulus PS, con el que se puede detectar y cuantificar endotoxinas, sin la interferencia de otras sustancias coexistentes, mediante el uso de un adsorbente de afinidad para la endotoxina denominado Pyrosep™. Con este método puede medirse la endotoxina en una muestra lipofílica siempre que se pueda disolver en etanol, como por ejemplo en vitaminas liposolubles, aceites y grasas, albúminas, entre otras que normalmente no pueden ser medidas con un ensayo de limulus convencional. Además, no se desaprovecha ningún reactivo LAL ya que se suministra individualmente en viales de ensayo simple y se puede usar en la cantidad exacta requerida para la medición.

La serie PYROSTAR™ ES-F es una formulación única que contiene Curdlan carboximetilado (CMC) coliofilizado con el LAL con el objetivo de eliminar la interferencia con β-glucanos. El ES-buffer desarrollado por Wako, contiene altas concentraciones de CMC, convirtiendo al reactivo LAL en específico a endotoxina. Este reactivo está diseñado para ser usado tanto para la detección cualitativa de las endotoxinas mediante cóagulos de gel (gel-clot), como para su cuantificación mediante métodos cinéticos turbidimétricos (KTA). Se utiliza un instrumento fotométrico como el Toxinometer® desarrollado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd., para medir la velocidad de cambio de la turbidez. Los kits PYROSTAR™ ES-F están disponibles con y sin Endotoxina Estándar de Control (CSE): un reactivo liofilizado que contiene endotoxina refinada a partir de E.coli y se utiliza para confirmar la sensibilidad del reactivo LAL, validar los métodos de prueba del producto y preparar controles de inhibición.

Como apoyo para estos reactivos, Wako también desarrolla una Solución Extractora de Endotoxina capaz de extraer endotoxinas de superficies de donde no se pueden extraer con agua o sal. Se recomienda su uso en los ensayos de endotoxinas sobre aparatos y dispositivos que podrían estar en contacto con fluidos que contienen sangre o proteínas.

El Toxinometer® ET-6000es un lector cinético de incubación computarizado que puede incorporar los 3 métodos de ensayo: gel-clot, KTA y KCA (ensayo cinético cromogénico). El equipo permite obtener los resultados de gel-clot y KTA de la misma muestra. Mide de manera simultánea hasta 16 muestras con un riesgo de contaminación mucho menor que la microplaca y permite el archivado de las curvas estándar. Toximaster® QC7 es el software que provee todas las funciones para el procesamiento de datos y preparación de los informes para la prueba LAL mediante el Toxinometer® ET-6000.

Además, entre los accesorios del catálogo LAL de Wako, están los tubos de ensayo con y sin tapas de aluminio. Están fabricados libre de endotoxinas de vidrio borosilicato y diseñados para el método gel-clot. El espesor del vidrio está calibrado específicamente al Toxinometer para una intensidad de luz y transmitancia estables.

Otro de los reactivos LAL que Wako comercializa es el kit KY Color Limulus. Este reactivo se ha diseñado para el método KCA y puede utilizarse tanto en el lector cinético como en un lector de microplacas. Incluye un kit multiensayo y un kit de ensayo simple, cada uno diseñado para un análisis colorimétrico en función del tiempo, que utilizan un sustrato sintético que genera un color amarillo y puede detectar específicamente la endotoxina con alta sensibilidad.

Bibliografía:

1) Iwanaga, S. Biochemical principle of Limulus test for detecting bacterial endotoxins. Proceedings of the Japan Academy, Series B, 83(4), 110-119. (2007).

2) Guideline on Validation of the Limulus Amebocyte Lysate Test as an End-Product Endotoxin Test of Human and Animal Parenteral Drugs, Biological Products and Medical Devices. U.S. Dept. of Health & Human Services, FDA, December (1987).

3) Katsuhito Inoue, Aya Takaoka, Masakazu Tsuchiya, Shuji Matsuura: Excerpt 110 (1992), 6th Annual Meeting of the Japanese Society for Alternatives to Animal Experiments.

4) Katsuhito Inoue, Tomoaki Harada, Masakazu Tsuchiya, Shuji Matsuura: Excerpt 44 (1994), 21st Annual Meeting of the Society for Antibacterial and Antifungal Agents.

5) Tsuchiya, M.; Oishi, H.; Takaoka, A.; Fusamoto, M. y Matsuura, S. Discrimination between endotoxin and (1–3) beta-D-glucan using turbidimetric kinetic assay with Limulus amebocyte lysate. Chem Pahrm Bull (Tokyo), 38(9). 2523. (1990).

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