Pros y contras de diferentes lecturas de detección de endotoxinas

Las endotoxinas bacterianas son pirógenos fuertes que pueden causar fiebre, inflamación e incluso shock séptico si obtienen acceso al torrente sanguíneo humano. Las endotoxinas, que son un componente integral de la membrana externa de las bacterias gramnegativas, son omnipresentes en el medio ambiente. Por lo tanto, los dispositivos médicos y los productos farmacéuticos destinados a uso parenteral deben someterse de forma rutinaria a pruebas de endotoxinas. El ensayo de lisato de amebocitos de Limulus (LAL) es la prueba estándar para la detección de endotoxinas,¹ que ha sido aprobada por instituciones reguladoras de todo el mundo y se ha incluido en la Farmacopea de EE. UU.

Métodos de ensayo de lisato de amebocitos de Limulus (LAL)

El ensayo LAL se puede realizar mediante tres metodologías principales: coágulo de gel, turbidimétrico y cromogénico.^2,3 El método de coágulo de gel se basa en la incubación de la proteína extraída del lisado de sangre de cangrejo herradura con endotoxinas, lo que da lugar a una reacción de coagulación. Los métodos turbidimétrico y cromogénico son variaciones del método del coágulo de gel. El método turbidimétrico se basa en la formación de turbidez (nubosidad) después de la escisión del sustrato endógeno, mientras que el método cromogénico se basa en la producción de cromógeno después de la escisión de un sustrato cromogénico.

Método de coágulo de gel LAL

El método de coágulo de gel LAL es cualitativo, sensible y fácil de usar. Es el método LAL más sencillo, que se basa en la formación de un coágulo de gel y se puede evaluar visualmente. LAL se extrae de amebocitos primitivos en la sangre del cangrejo herradura. El componente lípido A de la endotoxina interactúa con las enzimas pro-coagulantes en el LAL y activa una cascada de coagulación (que incluye el factor B, el factor C y una enzima procoagulante), lo que modifica el coagulógeno de los amebocitos y provoca la gelificación y la formación de coágulos.

Los kits de ensayo simple y de multi-ensayo PYROSTAR™ ES-F contienen reactivos específicos para endotoxinas (ES-F) de alta sensibilidad que no son activados por (1 → 3)-β-D-glucano y, por lo tanto, reducen la tasa de resultados falsos positivos. Los mismos kits que se utilizan para realizar el método de coágulo de gel también se pueden utilizar para realizar un ensayo cinético turbidimétrico (KTA).

Ensayo turbidimétrico cinético LAL

El ensayo turbidimétrico LAL es un ensayo LAL cuantitativo, automatizado y altamente sensible, que también se basa en la reacción gel-coágulo. Se basa en la formación de turbidez de la solución de prueba después de la escisión del sustrato endógeno y antes de la formación del gel. Un aumento más rápido de la turbidez indica niveles más altos de endotoxinas que se pueden cuantificar mediante un instrumento espectrofotométrico, como el Toxinometer®, o un lector de microplacas.

FUJIFILM Wako ofrece tres kits de KTA: PYROSTAR™ ES-F de ensayo simple para el Toxinometer®, PYROSTAR ™ ES-F de multi-ensayo para el Toxinometer® y PYROSTAR™ ES-F/Plate para el lector de microplacas, todos los cuales son específicos para endotoxinas. Los kits PYROSTAR™ ES-F de ensayo simple y multi-ensayo, utilizados en el sistema de medición Toxinometer®, tienen una sensibilidad mejorada con un rango de 0,001 a 10 UE/ml. El kit PYROSTAR™ ES-F/Plate, que permite realizar pruebas LAL de alto rendimiento, tiene un rango cuantitativo de 0,01 a 10 UE/ml.

Ensayo cromogénico LAL

El ensayo cromogénico LAL también es una modificación de la reacción gel-coágulo y permite mediciones de LAL automatizadas y altamente sensibles. El ensayo cromogénico LAL se basa en la adición de un sustrato cromogénico específico, que imita el sitio de escisión en el coagulógeno, al LAL. La reacción de coagulación provoca la hidrólisis del sustrato cromogénico, lo que libera el cromógeno amarillo p-nitroanilida (pNA) y permite la visualización de la reacción.

La serie Limulus Color KY de FUJIFILM Wako incluye el kit de ensayo simple Limulus Color KY para usar en el sistema de medición Toxinometer® y el kit de multi-ensayo Limulus Color KY que se puede utilizar en el Toxinometer® o en un lector de microplacas. Estos ensayos cromogénicos, cinéticos y cuantitativos tienen una sensibilidad extremadamente alta con un límite de detección de rango cuantitativo de 0,0002 UE/ml para el formato de ensayo simple y 0,0005 UE/ml para el formato de mult-ensayo. También incluyen reactivos específicos para endotoxinas y permiten realizar pruebas LAL de alto rendimiento cuando se utiliza la plataforma de microplacas.

¿Cuáles son los pros y los contras de las diferentes lecturas de detección de endotoxinas?

El ensayo LAL se puede realizar por tres metodologías principales: gel-coágulo, turbidimétrico y cromogénico. Los tres métodos son ampliamente aceptados y han encontrado amplias aplicaciones en la práctica (Tabla). El método LAL de gel-coágulo es el más sencillo; sin embargo, sigue siendo muy sensible y confiable. Los ensayos turbidimétricos y cromogénicos permiten la cuantificación de endotoxinas y una evaluación de mayor rendimiento. Sin embargo, requieren el uso de automatización adicional, mientras que el método de coágulo de gel no lo requiere. El ensayo cromogénico de FUJIFILM Wako tiene el límite de detección más bajo entre las tres metodologías, lo que lo hace especialmente útil en el caso de concentraciones de endotoxinas extremadamente bajas. Los kits de coágulos de gel y turbidimétricos PYROSTAR™ incluyen la misma línea de reactivos específicos de endotoxinas y pueden usarse durante diferentes etapas del desarrollo de productos farmacéuticos o dispositivos médicos.

Por lo tanto, aunque todos los métodos de ensayo LAL son sensibles, fiables y fáciles de usar, la selección de un ensayo individual debe basarse en las necesidades de los investigadores y adaptarse a las características específicas de los productos ensayados.

Bibliografía

1. Mehmood Y. What is Limulus amebocyte lysate (LAL) and its applicability in endotoxin quantification of pharma products. In: Growing and Handling of Bacterial Cultures. 2019 Jan 8. IntechOpen.
2. Joiner TJ, Kraus PF, Kupiec TC. Comparison of endotoxin testing methods for pharmaceutical products. International Journal of Pharmaceutical Compounding. 2002;6:408–409.
3. Wheeler A. Comparing endotoxin detection methods. Pharmaceutical Technology. 2017;41(11):58–62.

Tabla. Características de los ensayos FUJIFLM Wako para la detección de endotoxinas