Procedimientos de pipeteo y consejos para ejecutar un ensayo preciso

Published on 15th November 2022

Incluso pequeñas variaciones en los procedimientos de pipeteo pueden afectar seriamente los resultados del ensayo. Esto es de particular importancia si los hallazgos pueden ser relevantes para decisiones clínicas o de fabricación, como en el caso del ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) que se utiliza para evaluar la contaminación de endotoxinas en las muestras. Sin embargo, se han detectado imprecisiones en una proporción sustancial de personas que realizan el pipeteo manual, y especialmente al pipetear pequeños volúmenes. En un estudio, se encontró que la imprecisión de pipeteo intraindividual promedio fue del 5,7 %, 0,8 % y 0,2 % para pipetear 10 μl, 100 μl y 1 ml, respectivamente. Además, la imprecisión interindividual media fue del 8,1 %, 1,1 % y 0,4 % para pipetear 10 μl, 100 μl y 1 ml, respectivamente.1

Características de una técnica de pipeteo adecuada

Se deben considerar todos los pasos del procedimiento de pipeteo, incluida la preparación, la absorción de líquido (aspiración) y la descarga de líquido para garantizar el uso de una técnica adecuada.2 Se debe minimizar el manejo excesivo de la pipeta y la punta para evitar la contaminación. Se recomienda humedecer previamente la punta de la pipeta pipeteando el volumen seleccionado hacia arriba y hacia abajo. Para la absorción de líquido, la punta de la pipeta debe sumergirse unos pocos milímetros por debajo de la superficie del líquido y el líquido debe aspirarse lenta y uniformemente. Después de la aspiración, el experimentador debe hacer una pausa de 1 a 3 s para dejar que el líquido suba por la punta. Se debe aplicar una velocidad constante y una presión de émbolo durante toda la descarga de líquido. Finalmente, la punta debe examinarse antes y después de cada descarga de líquido para asegurarse de que se haya dispensado el volumen completo.

 

Además de las características descritas de una técnica de pipeteo adecuada, el seguir los siguientes consejos ayudaría a obtener resultados consistentes y confiables:

  1. Seleccione una técnica de pipeteo adecuada para cada solución: el modo de pipeteo estándar (directo) se usa para soluciones acuosas, que son la mayoría de las soluciones que se usan en experimentos de laboratorio. Se recomienda el pipeteo en modo inverso para líquidos con alta viscosidad o volatilidad.
  2. Seleccione una pipeta con un rango de volumen óptimo: el uso de una pipeta con un rango de volumen óptimo para los experimentos planificados reduce el riesgo de errores relacionados con el usuario. Para las pipetas de desplazamiento de aire comúnmente empleadas, este rango es del 35% al ​​100% del valor nominal.
  3. Manipule y mantenga las pipetas con cuidado: las pipetas deben revisarse diariamente para detectar contaminación. Cuando no estén en uso, deben almacenarse en un soporte de pipetas designado para evitar daños y deben mantenerse alejados de reactivos potencialmente dañinos.
  4. Realice una calibración regular: las pipetas deben calibrarse a intervalos regulares para mantener su precisión y exactitud dentro del rango recomendado (comúnmente ± 5 % de las especificaciones).3 La calibración debe realizarse en condiciones que se asemejen lo más posible a las condiciones experimentales reales. El intervalo de calibración recomendado depende tanto de la aplicación como de la frecuencia de uso de la pipeta.
  5. Garantice la formación en técnicas de pipeteo del personal de laboratorio: enseñar a los experimentadores una técnica de pipeteo adecuada es un requisito previo para obtener resultados experimentales fiables. Esta noción está respaldada por los hallazgos de un estudio realizado con el personal de un laboratorio forense, que mostró que el entrenamiento en técnicas de pipeteo mejoró la precisión del pipeteo.4
  6. Si es posible, trabaje a temperatura de equilibrio: si las condiciones y los requisitos experimentales lo permiten, el mantener la pipeta, las puntas y la solución a temperatura ambiente puede influir positivamente en la precisión de los resultados.
  7. Deseche la primera y la última dispensación: cuando se dispensan varias alícuotas, se recomienda desechar la primera y la última alícuota.
  8. Diseñe un plan experimental completo y eficiente: un plan experimental eficiente ayudaría a evitar errores relacionados con el usuario, especialmente al pipetear largas series de alícuotas en microplacas. Se están desarrollando aplicaciones web que facilitan la planificación experimental, como, por ej., Pipette Show.5

 

Referencias

  1. Lippi G, Lima-Oliveira G, Brocco G, Bassi A, Salvagno GL. Estimating the intra- and inter-individual imprecision of manual pipetting. Clin Chem Lab Med. 2017;55(7):962-966. doi: 10.1515/cclm-2016-0810.
  2. Ewald K. Impact of pipetting techniques on precision and accuracy. Eppendorf Userguide. No 20, May 2015. Available online at: https://www.eppendorf.com/uploads/media/USERGUIDE_20_GB_Final_25.pdf.
  3. Sanders ER. Aseptic laboratory techniques: volume transfers with serological pipettes and micropipettors. J Vis Exp. 2012;(63):2754. doi: 10.3791/2754.
  4. Epstein DM, Tebbett IR, Boyd SE. Eliminating sources of pipetting error in the forensic laboratory. Forensic Science Communications. 2003;5(4).
  5. Falk J, Mendler M, Kabisch J. Pipette Show: An open source web application to support pipetting into microplates. ACS Synth Biol. 2022;11(2):996-999. doi: 10.1021/acssynbio.1c00494.