Peligros de la interferencia de las pruebas de endotoxinas en los inyectables parenterales personalizados fabricados con virus adeno-asociados (AAV)
El riesgo de contaminación por endotoxinas de los vectores de virus adeno-asociados (AAV)
La terapia génica utiliza técnicas genéticas para producir una copia funcional de un gen o restaurar su función fisiológica, y tiene un gran potencial para el tratamiento de diversas enfermedades. Los vectores del virus adenoasociado (AAV) se derivan de parvovirus no patógenos, de replicación defectuosa y no envueltos, y pueden ser una herramienta eficaz para la liberación de genes. Las primeras terapias génicas basadas en AAV han obtenido aprobaciones reglamentarias tanto en Estados Unidos como en Europa.
Al igual que otros productos farmacéuticos o biológicos, las terapias basadas en AAV corren el riesgo de contaminación por endotoxinas. Las endotoxinas son potentes pirógenos que pueden provocar fiebre, inflamación y shock séptico si penetran en el sistema cardiovascular o linfático, el líquido cefalorraquídeo o el entorno intraocular. Están presentes en la membrana externa de las bacterias gramnegativas y se liberan al medio ambiente principalmente durante la lisis celular bacteriana. Dado que las terapias basadas en AAV se administran generalmente como inyectables parenterales, deben someterse a estrictas pruebas de endotoxinas.
Principios de las pruebas de endotoxinas
La prueba del lisado de amebocitos de Limulus (LAL) ha sido ampliamente aceptada como test de referencia (gold standard) para las pruebas de endotoxinas debido a su alta sensibilidad y especificidad. En consecuencia, ha sido adoptado por las farmacopeas de Estados Unidos, la Unión Europea y Japón. La prueba de LAL puede realizarse como ensayo cualitativo de coágulo de gel o como ensayo cuantitativo cromogénico o turbidimétrico. Además, se están desarrollando ensayos sintéticos de LAL para eliminar la necesidad de hemorragias de cangrejo herradura para la producción de reactivos de LAL.
Desafíos de las pruebas de endotoxinas de los vectores AAV
Las pruebas de endotoxinas de los vectores AAV están asociadas a varios desafíos. Por ejemplo, la fabricación de AAV es propensa a la contaminación por endotoxinas, y los inyectables parenterales basados en AAV requieren pruebas estrictas de endotoxinas. Además, como los productos basados en vectores AAV se fabrican normalmente a pequeña escala, los cronogramas de pruebas estándar no siempre son viables. Además, los productos derivados durante el proceso de fabricación del AAV pueden interferir con la prueba de LAL.
The value of alternative schedules for endotoxin testing of AAV vectors
Una vez garantizada la consistencia del proceso de fabricación, las empresas de producción a medida que fabrican vectores AAV y otros productos de terapia génica a pequeña escala deberían considerar programas alternativos de pruebas de endotoxinas. El American National Standards Institute (ANSI)/Association for the Advancement of Medical Instrumentation (AAMI) ha establecido pautas para el diseño de planes alternativos de pruebas de endotoxinas en el proceso y en el producto final. En particular, los planes de pruebas alternativas deben ajustarse a los requisitos reglamentarios, tener en cuenta las etapas clave de fabricación e incluir un plan de muestreo bien concebido.
Desarrollo de protocolos para la descontaminación de muestras de AAV
Se han desarrollado estrategias de Buenas Prácticas de Fabricación (BPF) para la producción de vectores AAV. Además, se están diseñando protocolos para la descontaminación de muestras concentradas de AAV. Al descontaminar los stocks de LAL, es importante mantener el nivel de detergentes por debajo de un umbral crítico, ya que los detergentes residuales pueden tener un efecto enmascarador, causando una interferencia con los reactivos de LAL.
El potencial de las cepas de E. coli de baja endotoxina
Además, se han propuesto cepas de E. coli de baja endotoxina para el aislamiento del ADN plasmídico como estrategia para disminuir el nivel de endotoxinas en las muestras de AAV. Según se informa, este enfoque es escalable y puede utilizarse tanto en laboratorios académicos como para el desarrollo clínico.
