Detección de endotoxinas mediante el ensayo de LAL, Método Turbidimétrico
En el anterior artículo de este blog hacíamos referencia al método Gel-Clot para cuantificar endotoxinas usando el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (LAL). El presente trabajo pretende ahondar más en el método turbidimétrico, que es otra de las técnicas utilizadas cuando se realiza el análisis de endotoxinas.
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Como se ha comentado el lisado de amebocitos de Limulus es útil para la detección de endotoxinas ya sea en materias primas o en productos terminados de las industrias farmaceúticas y de alimentos, entre otras, y también es usado con fines investigativos. Este ensayo puede ser llevado a cabo de manera cualitativa, semi-cuantitativa o cuantitativa, según sea necesario. El análisis cualitativo por el método de Gel-Clot es el más sencillo y barato, pues no requiere ningún equipo para detectar la formación del gel, que indica la presencia de endotoxinas y por lo tanto el resultado positivo del test de LAL. Otros métodos más costosos, pero a la vez más precisos son los colorimétricos y turbidimétricos. Siendo el método cinético turbidimétrico quizás el más utilizado, ya que requiere el uso de equipos al igual que el colorimétrico, pero no es necesaria la adición de ningún reactivo desarrollador de color.
La Turbidimetría: Técnica Analítica al servicio de las Investigaciones en Biomedicina, Microbiología y Biotecnología
La turbidimetría es una técnica analítica óptica que se basa en el fenómeno que ocurre cuando aparecen partículas sólidas en una disolución homogénea. Esta pérdida de homogeneidad hace que la luz que atraviesa la disolución no sea de igual intensidad que antes de aparecer la turbidez. Entendiéndose por turbidez “la propiedad óptica de una muestra que hace que la radiación sea dispersada y absorbida más que transmitida en línea recta a través de la muestra”. Si la luz transmitida es medida a una longitud de onda en particular se puede obtener un valor que es proporcional a la concentración de la sustancia, o sustancias presentes en la disolución responsable de la turbidez. Para estas mediciones se usa un espectrofotómetro, que es un equipo bastante común en un laboratorio analítico y también en los laboratorios clínicos. Se han desarrollado equipos específicos para esta técnica llamados turbidímetros, pero no son más que variantes de un espectrofotómetro.
Los métodos turbidimétricos son muy utilizados en biología, en primer lugar para controlar el crecimiento celular y el conteo de células en disolución y para otras técnicas analíticas relacionadas con la detección de microorganismos como es el ensayo LAL. Para controlar el crecimiento de una población de células, que pueden ser por ejemplo de bacterias, por turbidimetría hay que tener en cuenta que en la dispersión de la luz influye tanto el número de células como el tamaño de estas. La turbidimetría permite evaluar el crecimiento estimando la masa celular contenida en una muestra. Para evitar errores en las mediciones turbidimétricas se suelen medir curvas de patrones para cada microorganismo. Usando la turbidimetría se pueden obtener rectas que relacionan la transmitancia con el peso seco de microorganismos cuando estos se encuentran en disoluciones diluidas, cumpliéndose los principios de la Ley de Beer-Lambert.
Test de Lisado de Amebocitos de Limulus usando el Método Turbidimétrico
El principio del test de LAL es la reacción de coagulación que ocurre cuando los amebocitos extraídos del cangrejo Limulus Polyphemus entran en contacto con endotoxinas bacterianas. Las endotoxinas provocan que se desencadenen una serie de reacciones en cascada que finalizan con la precipitación de proteínas en forma de gel. La importancia de realizar este test a todos los productos farmacéuticos, alimenticios o de cualquier otro tipo que vayan a estar en contacto con humanos radica en el daño que pueden causar las bacterias Gram negativas en el organismo. Estas bacterias son las que liberan las endotoxinas cuando son atacadas por los mecanismos de defensa de los humanos y se rompe su pared celular. La liberación de endotoxinas provoca una respuesta inmune que tiene como resultado la liberación de citocinas. Altos niveles de citocinas en sangre pueden causar afecciones respiratorias severas, procesos asociados a muerte de gran cantidad de células, e incluso la muerte.
VEA: El impacto de las endotoxinas en el cuerpo humano
Cuando se desea aplicar la turbidimetría en los ensayos de LAL lo que medimos es la turbidez de la disolución al comenzar a formarse la coagulina, proteína insoluble responsable de la aparición de un gel en el tubo donde se lleva a cabo el ensayo. Teniendo patrones de endotoxina, podemos medir la turbidez por un método espectrofotométrico y esta medida nos permite cuantificar la cantidad de endotoxinas presentes, por lo que los resultados de este ensayo siempre son relativos. El análisis se puede llevar a cabo a través del método turbidimétrico de punto final o del método turbidimétrico cinético.
En el ensayo por turbidimetría de punto final hay que realizar la lectura de la turbidez a un tiempo determinado. Esto genera errores de manipulación y tiene la desventaja de que si en una muestra no se realiza la lectura correctamente hay que repetir todo el proceso, o sea hay un único momento para hacer la medición y debe ser preciso. De no leerse la turbidez en el momento indicado la gelificación continúa. Por estas razones este método no es muy usado.
Sin embargo el método turbidimétrico cinético ha tenido más éxito, en parte por los adelantos tecnológicos que en las últimas décadas han posibilitado acoplar lectores de placas multimedidas, con control de temperatura y todo el proceso de recogida de datos totalmente informatizado. Otra de las características de este método que lo hace muy popular a la hora de desarrollar un ensayo de LAL es su bajo límite de detección y el amplio rango de concentraciones de endotoxinas en que pueden realizarse las medidas, pudiendo construir curvas patrones en un rango de concentraciones de hasta 100 unidades de endotoxinas por mililitro de disolución.
La relación entre el tiempo de formación de la turbidez en el ensayo de LAL y la concentración de endotoxina es exponencial. Por lo que usando los antilogaritmos de la variable tiempo y los antilogaritmos de la concentración de las disoluciones patrón se puede obtener una línea recta. Mediante la recta obtenida por regresión se pueden conocer en experimentos posteriores las concentraciones de endotoxina en las muestras objeto de estudio. El factor temperatura juega un papel fundamental en estos ensayos, para obtener una buena reproducibilidad y exactitud en los resultados hay que asegurarse de controlar la temperatura. Es necesario trabajar a la temperatura indicada en cada protocolo.
Se han investigado diferentes variantes del ensayo de LAL usando la turbidimetría, que han dado como resultado test rápidos de detección de endotoxinas realizando el ensayo a temperaturas superiores a las usuales que son alrededor de 37 ºC, o por ejemplo la introducción de los reactivos en nanopartículas.
El Test Limulus ES-2 y el PYROSTAR™ ES-F/Plate, son productos que vende la división LAL de Wako y que sirven para la detección de endotoxinas bacterianas, aplicando el método cinético de turbidimetría. Estos productos se venden para ser usados en mediciones realizadas con fines investigativos, en ningún caso deben ser usados como métodos de diagnóstico.
Para usar el reactivo PYROSTAR™ ES-F/Plate es necesario contar con un lector de microplacas como es el Tecan Sunrise™ Microplate Reader y el software correspondiente. El procedimiento a seguir consiste en hacer mediciones para tener una curva de calibrado que cubra entre 10 unidades menos y 10 más de las que se presume que se encuentran las muestras. Se realizan medidas en controles positivos y negativos y las muestras se miden por duplicado, para asegurar la calidad de las mediciones. Se deben tomar medidas cada 40 segundos, a 405 nm y a una temperatura de 37 ºC de cada uno de los pocillos de la microplaca, una vez añadido en reactivo PYROSTAR™ ES-F/Plate a las muestras. El lector de microplacas monitorea la turbidez de las muestras para determinar el tiempo que tarda en aparecer esta y con los datos de transmitancia el software calcula la curva de regresión que permite determinar la concentración de endotoxinas. Este reactivo incluye el Curdlan (β-1,3-glucano) para eliminar la interferencia que produce este compuesto y se vende con endotoxina estándar de control, o sin esta sustancia.
La división LAL de Wako, también fabrica un instrumento fotométrico que puede ser utilizado para medir la velocidad del cambio en la turbidez de la disolución en el ensayo de LAL, llamado Toxinometer®. Este equipo utiliza un LED de 430 nm como fuente de luz y entre otras ventajas tiene la del control de la temperatura, tan importante en este ensayo.
