Las endotoxinas bacterianas como contaminantes de proteínas terapéuticas

La pureza de una proteína que va a ser usada con fines terapéuticos es de vital importancia. Desde las pruebas necesarias para saber si una proteína va a ser viable como fármaco es imprescindible que esta tenga un alto grado de pureza y no ocasione reacciones inmunológicas indeseadas en los organismos donde se realizan los ensayos previos a su utilización. Las impurezas de una proteína terapéutica pueden ser moléculas similares obtenidas como parte de la biosíntesis de la proteína, o provenir del sustrato celular utilizado en su producción o del propio proceso productivo.

Es necesario estudiar los tipos de contaminantes que están presentes en cualquier formulación de proteína que va a ser usada con fines médicos, ya que estos contaminantes pueden alterar tanto el perfil de respuesta al principio activo como los resultados de los ensayos de toxicidad.

Una proteína obtenida en el laboratorio, contaminada con endotoxinas bacterianas, provocará fiebre y otras reacciones que no se podrá distinguir si son causadas por la proteína en sí o por el contaminante. Es muy frecuente obtener respuesta inmune a los productos terapéuticos, incluso a los que tienen mucha semejanza con las moléculas endógenas, y estas reacciones afectan la eficacia del fármaco e incluso puede declararse que es un producto no seguro, de aquí que sea necesario realizar un control estricto de la presencia de lipopolisacáridos provenientes de bacterias Gram negativas (endotoxinas bacterianas), tanto en el proceso de obtención de estas proteínas como en el producto final. Considerando los datos que arrojan estos estudios, se varían las condiciones en que se lleva a cabo la producción de la proteína, sobre todo el proceso de purificación para lograr la pureza deseada.

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La contaminación de las proteínas terapéuticas por endotoxinas durante el proceso de producción puede decirse que es frecuente, debido a que estos productos se obtienen en algunos casos mediante la modificación genética de bacterias u otros organismos, que pueden estar contaminados con las mismas, y a que los procesos de purificación pueden no ser suficientes para eliminar totalmente células del hospedero que sintetizó la proteína o las estructuras microbianas.

No siempre es sencillo determinar la cantidad de endotoxinas bacterianas presentes en una formulación de proteínas terapéuticas. El ensayo de LAL (lisado de amebocitos Limulus) es el método utilizado actualmente, aunque tiene el inconveniente de que los (1–3)- β-D-glucanos, muchas veces presentes en este tipo de muestras, pueden interferir en la medida de las endotoxinas. Para ello la división LAL de Wako cuenta con diferentes kits que tienen añadido el CM-curdlan, que es un derivado carboximetilado de (1–3)- β-D-glucano, que cuando se encuentra en el medio donde se realiza el ensayo de LAL en altas concentraciones, elimina la interferencia de los compuestos de esta familia.

El kit Limulus PS Single de Wako puede utilizarse para la determinación de lipopolisacáridos en formulaciones de proteínas que van a ser usadas con fines terapéuticos. Este kit está formado por el reactivo ES de LAL, que permite mediciones por el método turbidimétrico cinético, y una suspensión de Pyrosep. El Pyrosep es una resina de afinidad específica para endotoxinas, compuesta por un soporte insoluble en agua conjugado mediante un espaciador con la histidina, que es la molécula que actúa como ligando. Usando este kit pueden realizarse determinaciones en medios hidrofóbicos, con la ventaja de necesitar una pequeña cantidad de muestra para el ensayo.

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Desde los años 50 del siglo pasado algunos autores proponen que una pequeña cantidad de endotoxinas, u otras especies que activen la respuesta inmune del organismo, puede ser beneficiosa para que la proteína terapéutica tenga más efectividad en su acción, ya que facilitan la generación de una respuesta inmune. Recientemente se han publicado varios trabajos científicos en que se estudian los mecanismos involucrados en estos procesos. Las endotoxinas actúan directamente sobre los receptores innatos del sistema inmune, que activan la producción de citocinas, especies reactivas de oxígeno y otras quimiotoxinas, además de aumentar la interacción con el antígeno.

Bibliografía:

1) Bonnerjea, J., Methods in Molecular Biology, 244, 455-462, 2004.

2) Johnson AG, Gaines S, Landy M., J Exp Med., 103, 225–246, 1956.

3) Verthelyi D and Wang V., Plos One, 5 (12), e15252, 2010.

PRODCUTOS UTILIZADO EN EL MÉTODO LAL

PYROSTAR™ ES-F (2 ML) (sin CSE)	Agua sin endotoxina	Toxinometer® ET-6000