La necesidad de ensayos LAL para la detección de endotoxinas

Una historia de tragedias dio origen a la necesidad del ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) para la detección de endotoxinas en la industria alimenticia y médico farmacéutica de la actualidad.

Se trata de una historia de morbilidades y mortalidades desafortunadas y del papel de la detección selectiva de endotoxinas establecida como una barrera para prevenir la repetición de dichos sucesos.

En 2010 Baxter, una corporación bien establecida y líder a nivel mundial en la industria farmacéutica, descubrió la presencia de endotoxinas bacterianas en varios de sus productos. Afortunadamente, el descubrimiento de esta contaminación se realizó en una era en la que la detección selectiva de endotoxinas bacterianas era un proceso de rutina realizado antes del ingreso y la circulación del producto final en el mercado. Por lo tanto, se tomaron las medidas preventivas necesarias y se evitó un hecho catastrófico.

Este incidente ejemplifica claramente la necesidad y el beneficio absoluto de los reactivos LAL para la prevención de brotes de enfermedades a gran escala con motivo de la contaminación de productos con endotoxinas.

Peanut Corporation of America no fue una empresa afortunada. La empresa obtuvo el récord por el retiro masivo de productos del mercado en la historia de los Estados Unidos. En 2008 los productos de mantequilla de maní de esta empresa se contaminaron con Salmonella, una bacteria Gram-negativa que genera endotoxinas. Los productos contaminados circularon por toda la nación y su consumo produjo 200 enfermos graves y 9 muertes. En consecuencia, Peanut Corporation of America debió cerrar ese mismo año y sus ejecutivos recibieron infinidad de demandas penales después de esta tragedia.

La repercusión de haber expedido productos contaminados con bacterias y endotoxinas al público en general fue abrumadora. Se desconoce la cantidad exacta de vidas que fueron afectadas por muerte o incapacidad. Para cualquier empresa que no haga bien los deberes, un pequeño error supera por lejos cualquier ganancia pasada, presente y futura que pueda obtener. Un error borra cualquier existencia o contribución de la empresa en la sociedad.

La epidemia de Salmonella más grande en la historia de Estados Unidos ocurrió en 1985 en el norte de Illinois. La empresa de lácteos Hillfarm Dairy a cargo de Jewel Companies, Inc. producía leche contaminada por antibióticos resistentes a la cepa de la Salmonella, S. typhimurium. La supuesta cantidad de individuos afectados superó los 150.000. Asombrosamente, se confirmaron unos 16.000 casos a través de análisis de laboratorio con Salmonella y se detectó la muerte de 9 personas. La empresa Hillfarm Dairy debió cerrar su sede en Melrose Park por dicho descuido.

Otra bacteria que produce endotoxinas y genera las epidemias de contaminación alimenticia más populares es la Escherichia coli. E. es un habitante natural en los intestinos del ser humano y otros mamíferos. Junto con la Salmonella, E. coli representa la mayor cantidad de casos de envenenamiento por bacterias en los alimentos.

El peor caso de epidemia por E. coli se registró en 2011 y ocurrió al norte de Alemania. Las estadísticas revelaron que 3.950 personas sufrieron enfermedades y 53 murieron como consecuencia de la epidemia. Se investigó que la cepa de E. coli responsable por estos incidentes fue el serotipo O104:H4. Fue una sola cepa que produjo las toxinas Shiga que derivaron en síntomas de diarrea con sangre y síndrome urémico hemolítico (SUH). El SUH es un grupo de enfermedades caracterizadas por la destrucción de glóbulos rojos, la insuficiencia renal y la disminución de plaquetas, entre otros síntomas. Varias investigaciones permitieron que las autoridades concluyan que la posible fuente de infección fueran los brotes de alfalfa, provenientes de la Baja Sajonia, Alemania, o importados desde Egipto. Una vez más la empresa identificada como la emisora de alimentos contaminados debió cerrar.

Las endotoxinas producidas por la Salmonella y la E. coli, cuando se introducen en el cuerpo humano, estimulan respuestas del sistema inmunológico y secretan efectos producidos por la actividad de varias células de defensa. Estos sistemas celulares de defensa incluyen el sistema de cascada de complemento, la cascada de la coagulación y la respuesta inflamatoria. El sistema de cascada de complemento es el responsable del reconocimiento de la endotoxina, su procesamiento y su introducción en el sistema inmunológico. La respuesta inflamatoria después toma medidas para contrarrestar esta presencia y eliminar o contener a las endotoxinas. Se pueden generar varios productos metabólicos durante estas reacciones que utilizan todas las vías para reaccionar de manera simultánea. Estas vías son las responsables de producir la sensación de malestar durante el ciclo de la enfermedad. El sistema inmunológico puede terminar agobiado o la respuesta producida puede ser excesiva y continuar causando incluso más daño al organismo. El sistema de la coagulación puede generar coágulos de sangre que podrían bloquear el flujo sanguíneo y así causar insuficiencia en el funcionamiento de algún órgano. El mecanismo de coagulación también puede verse afectado y el paciente puede terminar sufriendo un sangrado interminable. El sistema inflamatorio puede estimular la fiebre, el sarpullido leve y un choque anafiláctico mortal. Los efectos no controlados de la endotoxina en el cuerpo finalmente derivan en un choque séptico, insuficiencia en múltiples órganos y muerte.

Las amenazas impuestas a la humanidad por los productos contaminados con endotoxinas son constantes. Por esta principal razón, la Administración de Drogas y Alimentos (FDA) de Estados Unidos aprobó el uso de las pruebas de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) para detectar la presencia de endotoxinas en los productos manufacturas antes de liberarse al mercado. Los ensayos LAL han sido aprobados por la FDA por más de 30 años y son parte de la guía desde el aviso del Registro Federal (42 FR 57749) emitido en 1977, que declara que el LAL se puede utilizar como un ‘Ensayo para la detección de endotoxinas en el producto final’ en los medicamentos aplicados por vía parenteral en seres humanos y animales, los productos biológicos y los dispositivos médicos. La necesidad obvia de detección selectiva de endotoxinas extiende el uso de los sistemas de detección de LAL a los productos alimenticios y al agua.

Las ventajas ofrecidas por los productos LAL de PYROSTAR™

Desde 1977 se publican los lineamientos de la FDA sobre los LAL, que se han convertido en la regla de oro para la detección de endotoxinas en la preparación de productos comerciales y, en consecuencia, muchas empresas han desarrollado sus propios sistemas de ensayos LAL. El obstáculo más grande para seleccionar el mejor sistema de detección de endotoxinas es la variabilidad. La variabilidad se define como el grado en que un dato difiere del estándar. A su vez, significa el grado en que un dato difiere de otro dato. En el caso de los ensayos de LAL, es más adecuado describir la variabilidad como la diferencia de resultado entre las diferentes preparaciones de LAL. Son diversos los factores que contribuyen con dicha variabilidad. El LAL consiste en una prueba biológica; el reactivo en sí mismo es un producto biológico generado por el cangrejo herradura. La endotoxina analizada es un producto biológico de la bacteria Gram-negativa. En comparación con las pruebas químicas, las pruebas biológicas se ven afectadas por muchísimos factores que pueden incrementar la variabilidad.

Casi todas las preparaciones de reactivos LAL no solo reaccionan ante las endotoxinas bacterianas, sino también ante la presencia de β-1,3 glucano. El β-1,3 glucano es un polisacárido que se encuentra de manera natural en bacterias, plantas y hongos. Cualquier β-1,3 glucano presente en las muestras de ensayo seguramente determine el resultado positivo de la detección de endotoxinas, inclusive cuando no haya ninguna presente. Esto reduce la especificidad del ensayo. Para contrarrestar esta reacción cruzada, algunas preparaciones de LAL utilizan soluciones amortiguadoras; sin embargo, la presencia de este tipo de soluciones en sí misma contribuye con el aumento de la variabilidad.

El LAL de PYROSTAR™ utiliza una absorción específica de endotoxinas con filtración de los posibles reactivos cruzados. De esta forma permite que los ensayos sean exclusivamente específicos para las endotoxinas y, en consecuencia, elimina la reactividad cruzada con β-1,3 glucanos. Por lo tanto, el LAL de PYROSTAR™ brinda una mayor especificidad para la detección de endotoxinas. Esta característica evita la necesidad de agregar soluciones amortiguadoras en la solución y así disminuye la variabilidad del LAL de PYROSTAR™.

La detección de endotoxinas se realiza a través de 3 métodos estándar: el ensayo con coágulos de gel, el ensayo turbidimétrico y el ensayo cromogénico. Los 3 métodos están disponibles en la línea de productos de PYROSTAR™ como Ensayo con coágulos de gel, Ensayo Cinético Turbidimétrico (KTA) y Ensayo Cinético Cromogénico (KCA). Los 3 métodos varían entre sí y cada uno tiene su propio rango de detección con KCA, lo que destaca una sensibilidad muy alta, de hasta 0.0002 Eu/ml para el ensayo simple y 0.0005 Eu/ml para ensayos múltiples. Además, si cuenta con el sistema de Toxinómetro™ ET-6000, que permite una lectura automática de estos 3 tipos de ensayo, los procedimientos se realizan de manera adecuada y sin esfuerzo alguno.

El ensayo de coágulos de gel es el menos susceptible a la inhibición, que consiste en la presencia de alguna sustancia en la muestra del ensayo que podría disminuir la detección de endotoxinas y aumentar un resultado falso negativo. Para evitar esta situación, Wako desarrolló el ensayo Simple de Limulus PS que permite analizar las muestras sin las inhibiciones comunes de los ensayos LAL tradicionales. Incluso permite que las pruebas se realicen sobre vitaminas liposolubles, aceites y grasas, si pueden disolverse en etanol.

En el caso de los que trabajan con ensayos con microplacas, las «aguas termales» son cámaras de ensayo contaminadas que pueden generar preparaciones no esterilizadas o configurar el ensayo de manera tal que permite un manejo inapropiado de los especímenes y los materiales. Una vez más la presencia de «aguas termales» afecta la variabilidad en la detección de endotoxinas. La disponibilidad de la configuración de ensayos simples de PYROSTAR™ disminuye la posibilidad de la presencia de «aguas termales» y así reduce la variabilidad.

En resumen, los productos LAL de PYROSTAR™ de Wako se desarrollaron para crear un mejor sistema de detección de endotoxinas que corrige los problemas actuales con ensayos LAL tradicionales y además ofrece ventajas de conveniencia, sensibilidad incrementada, especificidad y disminución de la variabilidad.

ACCESORIOS UTILIZADOS EN EL ENSAYO LAL

Toxinómetro™ ET-6000 Series	Agua reactivo LAL (LRW)	Endotoxina estándar de control (CSE)