La importancia del uso de glucano en los ensayos de LAL

Mediante el ensayo de LAL (Lisado de amebocitos de Limulus) se puede determinar la presencia de endotoxinas bacterianas en diferentes medios, disoluciones, material de laboratorio, aire, entre otros. Este ensayo ha cobrado gran importancia en la industria y la investigación en las últimas décadas, imponiéndose como el ensayo más fiable para la detección de pirógenos. El ensayo de LAL se basa en la cadena de reacciones que provocan las endotoxinas bacterianas, provenientes de las bacterias Gram negativas, en la hemolinfa del cangrejo Limulus Polyphemus o cangrejo herradura, nombre común con el que es conocido este cangrejo. La cadena de reacciones da como resultado la coagulación de la hemolinfa que es fenómeno que se utiliza para la determinación analítica. Pero existen otros compuestos que también provocan la gelificación en el lisado de amebocitos del cangrejo herradura provocando interferencia en el ensayo de endotoxinas bacterianas, algunos de estos compuestos son (1,3)-β-D-glucanos, que dan lugar a falsos positivos en el ensayo de LAL.

Los (1,3)-β-D-glucanos son compuestos polisacáridos constituidos por monómeros de glucosa, específicamente monómeros de D-glucosa unidos a través de enlaces β-glicosídicos, que son producidos por muchos organismos procatiotas y eucariotas. Una de las principales fuentes de contaminación de glucanos en los laboratorios proviene de la celulosa del papel, pues estos compuestos se encuentran en la pared celular de las células de los árboles. Como la operación de filtrado es muy frecuente en los laboratorios y esta se realiza en muchas ocasiones con papel de filtro de celulosa, es común que las muestras estudiadas para la detección de endotoxinas bacterianas contengan (1,3)-β-D-glucanos. Las muestras también pueden estar contaminadas por el contacto con otros organismos productores de glucanos.

Los glucanos también están considerados como patógenos en los mamíferos, por lo que en algunas investigaciones no es un problema que al realizar el ensayo de LAL se obtenga un resultado alterado por la presencia de glucanos. Los glucanos son considerados moléculas proinflamatorias y con actividad inmunológica, además de que son capaces de activar los linfocitos, macrófagos y la cascada del complemento. Pero en la práctica es frecuente que el investigador necesite conocer la concentración de endotoxinas bacterianas sin la interferencia de los glucanos. Esto sucede sobre todo cuando el ensayo de LAL se usa como método de detección de pirógenos, ya que los glucanos en general son sustancias que no causan fiebre.

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En el ensayo de LAL un resultado positivo viene dado por la gelificación que ocurre en la disolución debido a la formación de la proteína coagulina, que es una de las sustancias obtenidas por la cadena de reacciones de defensa que desencadena el factor C presente en la hemolinfa del cangrejo ante la presencia de endotoxinas bacterianas. Cuando las sustancias exógenas presentes son (1,3)-β-D-glucanos, es el factor G el que se activa, pero también da lugar a que se produzca la coagulina, por lo que el resultado es igual a si hay endotoxinas bacterianas presentes en la disolución. Una alternativa para eliminar la interferencia de los glucanos en el test de LAL es remover el factor G del lisado de amebocitos, que es la parte reactiva, o inhibir la reacción que se produce entre el factor G y los glucanos.

Los glucanos contaminantes pueden provenir de diferentes organismos, por ejemplo, el zimosano de las levaduras, la laminarina de las algas, el lentinan que es usado como fármaco antitumoral y proviene de los hongos shiitake o el curdlan que producen las bacterias. En Wako se utiliza precisamente el curdlan obtenido de bacterias para realizar la metilación y obtener el curdlan carboximetilado, que añadido en grandes cantidades al medio donde se realiza el ensayo de LAL hace que los glucanos no interfieran en las medidas. Así los test disponibles en Wako para la determinación de endotoxinas bacterianas mediante el ensayo de LAL de las series Pyrostar ES-F, Limulus Color KY y Limulus PS, contienen en la mezcla de reactivos liofilizados el curdlan carboximetilado.

Otros reactivos y materiales disponibles en Wako para la realización del ensayo de lisado de amebocitos de Limulus son:

• Disolución extractora de endotoxinas (Endotoxin Extracting Solution for LAL Test), que contiene albúmina de suero humano, sustancia que hace que la extracción de endotoxinas de las muestras se realice con mayor eficiencia que si se hace solo con disolución salina.

• Tubos para la determinación cualitativa de endotoxinas por formación de gel (Gel Clot Reaction Tubes).

• Disolución control estándar de endotoxina (Control Standard Endotoxin), que contiene 500 ng de endotoxina purificada y liofilizada de la cepa E. Coli UKT-B, usada como patrón en los ensayos de LAL.

• Agua para usar en los ensayos de LAL (Lysate Reagent Water), que está esterilizada y libre de endotoxinas.

• Tips para micropipetas y tapas de aluminio para los tubos de la serie BioClean®, que garantizan la ausencia de endotoxinas y que pueden ser usados con el Toxinómetro.

Existen otros factores que pueden causar interferencias en el método de LAL, como son el pH, una alta concentración de sales o la presencia de moléculas quelatantes como puede ser la heparina, pero ya estos temas serán tratados con mayor profundidad en otro artículo que publicaremos próximamente en este blog.

Bibliografía:

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3. Pool, J., Joharr, G., James, S., Petersen, I., Bouic, P., Journal of Immunoassay, 20, 79-89, 1997.

4. Roslansky, P. F., Novitsky, T. J., Journal of Clinical Microbiology, Nov., 2477-2483, 1991.

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